С.Н. Еланский, Л.Ю. Кокаева, М.В. Стацюк, Ю.Т. Дзякаў
Увядзенне
Оомицет Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - узбуджальнік фітафтарозу, самай эканамічна важнай хваробы бульбы і тамата - ужо больш як паўтара стагоддзя прыцягвае пільную ўвагу даследчыкаў з розных краін. Раптоўна з'явіўшыся ў Еўропе ў сярэдзіне XIX стагоддзя, ён выклікаў эпідэмію бульбы, якая засталася ў памяці шматлікіх пакаленняў.
Да гэтага часу яго часта называюць «грыб ірландскага голаду». Амаль сто гадоў праз пасля першых эпідэмій былі выяўленыя ўстойлівыя да фітафтарозу дзікія мексіканскія віды бульбы, распрацаваны метады іх скрыжавання з культурнай бульбай (Muller, 1935 года) і атрыманы першыя фитофтороустойчивые гатункі (Пушкары, 1937 г.). Аднак неўзабаве пасля пачатку іх камерцыйнага вырошчвання назапасіліся вірулентные да ўстойлівых гатункам расы ўзбуджальніка фітафтарозу. і ўводзяцца ў гатункі новыя гены ўстойлівасці з дзікага мексіканскага бульбы сталі хутка губляць эфектыўнасць.
Няўдачы з выкарыстаннем моногенной (вертыкальнай) ўстойлівасці прымусілі селекцыянераў шукаць больш складаныя шляхі эксплуатацыі неспецыфічнай полигенной (гарызантальнай) устойлівасці. У апошнія гады ў асобных папуляцыях паразіта сталі назапашвацца высокоагрессивные расы, якія выклікаюць эрозію нават неспецыфічнай устойлівасці. З'яўленне ўстойлівых да фунгіцыдамі штамаў выклікала праблемы пры выкарыстанні хімічных сродкаў абароны бульбы.
З прычыны значных адрозненняў оомицетов ад грыбоў па хімічным складзе, ультраструктуры і метабалізму фунгіцыды, асабліва сістэмныя, якія ўжываюцца для абароны раслін ад шматлікіх грыбных хвароб, супраць оомицетов неэфектыўныя.
Таму ў хімічнай абароне ад фітафтарозу выкарыстоўвалі шматразовыя (да 12 разоў за сезон і больш) апырсквання кантактнымі прэпаратамі шырокага спектру дзеяння. Рэвалюцыйным крокам стала ўжыванне фениламидов, таксічных для оомицетов і сістэмна распаўсюджваюцца ў раслінах. Аднак паўсюднае іх ужыванне хутка прывяло да назапашвання ў грыбных папуляцыях рэзісцентный штамаў (Davidse et al., 1981), што істотна ўскладніла абарону раслін. P. infestans з'яўляецца практычна адзіным паразітам ўмеранага пояса, шкоду ад якога ва ўмовах арганічнага земляробства немагчыма нейтралізаваць без прымянення хімічных сродкаў абароны (Van Bruggen 1995).
Вышэйсказанае тлумачыць тое вялікая ўвага, якое надаюць даследчыкі з розных краін вывучэнню папуляцый P. infestans, дынаміцы іх колькасці і генетычнага складу, а таксама генетычным механізмам зменлівасці.
Жыццёвы цыкл Р. INFESTANS
Оомицет Phytophthora infestans развівае ўнутры лісця бульбы міжклеткавую грыбніцу з гаусториями. Сілкуючыся тканінамі ліста, ён выклікае адукацыю цёмных плям, якія ў вільготнае надвор'е чарнеюць і загніваюць. Пры моцным паразе гіне ўвесь ліст. Пасля перыяду харчавання на грыбніцы утвараюцца вырасты - спорангиеносцы - якія прарастаюць вонкі праз вусцейкі. Ў вільготнае надвор'е яны ўтвараюць налёт белага колеру вакол плям з ніжняга боку лісця. На канцах спорангиеносцев фармуюцца лимоновидные зооспорангии, якія адрываюцца і разносяцца пырскамі дажджу (мал. 1). Трапляючы ў кроплі вады на паверхні ліста бульбы, спорангии прарастаюць 6-8 зооспоры, якія пасля перыяду руху акругляюцца, пакрываюцца абалонкай і прарастаюць ростковой трубкай. Парастак праз вусцейкамі пранікае ў тканіну ліста. Пры пэўных умовах спорангий можа прарастаць ростковой люлькай напрамую ў тканіну ліста. Пры спрыяльных умовах час ад заражэння да адукацыі новага спороношения складае ўсяго 3-4 дня.
Трапляючы на зямлю і профильтровываясь праз глебу, спорангии здольныя заражаць клубні. Моцна здзіўленыя клубні пры захоўванні згнівала; ў слаба здзіўленых інфекцыя можа захоўвацца да наступнага сезона. Акрамя таго, узбуджальнік фітафтарозу можа захоўвацца на зімовы перыяд у выглядзе ооспор (таўстасценныя спачываюць палавыя спрэчкі) у глебе на раслінных рэштках і на насенні тамата. Ооспоры ўтвараюцца на жывых органах раслін пры сустрэчы штамаў розных тыпаў спарвання пры залішнім увільгатненні. Увесну на пасаджаных заражаных клубнях і на раслінных рэштках з ооспоры утворыцца бясполае спороношение, зооспоры выходзяць у глебу і выклікаюць заражэнне ніжняга лісця раслін. У некаторых выпадках міцэліем можа расці з заражанага клубня па зялёнай часткі расліны і выяўляцца, як правіла, у верхняй частцы сцябла.
Сур'ёзнае адрозненне оомицетов ад большасці грыбоў заключаецца ў перавазе диплофазы ў іх жыццёвым цыкле з гаметическим мейозом і прарастання зігота (ооспор) без рэдукцыйнага дзялення ядраў. Гэтая асаблівасць плюс диполярный гетероталлизм, які замяняе двуполых, здавалася б, дазваляюць прымяніць да оомицетам падыходы, распрацаваныя для вывучэння папуляцый вышэйшых эукарыёт.Асноўныя (аналіз панмиксии і падраздзяленнямі папуляцый, унутры-і межпопуляционных патокаў генаў і інш.). Аднак тры фактары не дазваляюць цалкам пераносіць гэтыя падыходы пры вывучэнні папуляцый P. infestans.
1. Нараўне з гібрыднымі ооспоры у папуляцыях утвараюцца самофертильные і партеногенетические ооспоры (Fife, Shaw, 1992; Анікін і інш., 1997а; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina 2002; Смірноў, 2003), прычым частата іх адукацыі можа быць дастатковай, каб паўплываць на вынікі аналізаў.
2. Палавы працэс у P. infestans ўносіць нязначны ўклад у дынаміку колькасці папуляцый, бо грыб размножваецца галоўным чынам вегетатыўнымі спрэчкамі, утвараючы заРезультаты ПЦР-аналізу з дапамогай спецыфічных праймер больш, чым на 90% супалі з вынікамі аналізу тыпу спарвання традыцыйным спосабам на пажыўнай асяроддзі . вегетацыйны перыяд некалькі генерацый бясполага спороношения (поліцыклічныя развіццё хваробы). Ооспоры гуляюць важную ролю ў захаванні арганізма ў перыяд, калі адсутнічаюць зялёныя расліны (зімой) і ў першасным заражэнні ўсходаў. Затым, на працягу лета, адбываецца клонально размнажэнне і павелічэнне або, наадварот, падзенне колькасці асобных клонаў, якія ўзніклі ў выніку палавой рэкамбінацыі, што вызначаецца галоўным чынам адборам больш прыстасаваных. Таму суадносіны асобных клонаў у папуляцыі ў пачатку і канцы эпифитотии можа быць цалкам розным.
3. Апісаны цыкл характэрны для натыўных папуляцый P. infestans на іх радзіме - у Цэнтральнай Амерыцы. У іншых зонах свету на працягу больш за 100 гадоў палавой працэс не быў вядомы, зимующей стадыяй быў вегетатыўны міцэліем ў заражаных клубнях бульбы. Жыццёвы цыкл быў цалкам агамным, а распаўсюджванне насіла очаговый характар: інфекцыя з адзінкавых заражаных высаджаных клубняў пераходзіла на лісце, утвараючы першасныя ачагі хваробы, якія маглі злівацца пры масавым развіцці захворвання.
Такім чынам, у адных рэгіёнах можа быць чаргаванне палавога і бясполага цыклаў, а ў іншых - толькі бясполы цыкл.
Паходжанне P. INFESTANS
P. infestans з'явіўся ў Еўропе ў канцы першай паловы XIX ст. Паколькі радзімай бульбы з'яўляецца Паўночна-Усходняя частка Паўднёвай Амерыкі, меркавалася, што паразіт быў прывезены адтуль у Еўропу падчас буму чылійскай салетры. Аднак даследаванні, выкананыя на бульбяной станцыі Ракфелераўскім цэнтра ў даліне Толука (Мексіка), прымусілі перагледзець гэты пункт гледжання (Niederhauser, 1991, 1993).
1. У даліне Толука мясцовыя клубненосный віды бульбы (Solanum demissum, S. bulbocastanum і інш.) Валодаюць рознымі наборамі генаў вертыкальнай ўстойлівасці ў спалучэнні з высокім узроўнем неспецыфічнай ўстойлівасці, што сведчыць аб доўгай коэволюции з паразітам. Амерыканскія віды, уключаючы культурны бульба, не маюць генаў устойлівасці.
2. У даліне Толука сустракаюцца изоляты з тыпамі спарвання А1 і А2, з прычыны чаго распаўсюджана интербредная папуляцыя P. infestans; у той час як на радзіме культурнага бульбы, у Паўднёвай Амерыцы, паразіт распаўсюджваецца клонально.
3. У даліне Толука назіраюцца штогадовыя жорсткія эпідэміі фітафтарозу. Таму сярод паўночнаамерыканскіх даследчыкаў (Корнельского універсітэт) ўстаялася меркаванне аб невяковай Мезаамерыкі (Цэнтральнай Амерыцы), як радзіме бульбяной фітафторы (Goodwin et al., 1994).
Амерыканскія даследчыкі не падзяляюць гэта меркаванне. Яны лічаць, што культурны бульба і яго паразіт P. infestans маюць агульную радзіму - амерыканскія Анды. Свой пункт гледжання яны падмацавалі малекулярнымі даследаваннямі па аналізе ДНК-палімарфізмам мітахандрыяльнай геному (мтднк) і ядзерных генаў RAS і β-тубулина (Gomez-Alpizar et al., 2007). Яны паказалі, што штамы, сабраныя ў розных месцах свету, адбыліся ад трох дивергентных анцестральных ліній, якія (усе тры) знойдзены ў паўднёваамерыканскіх Андах. Андскі гаплатыпы - нашчадкі двух ліній: изоляты самай старой лініі мтДНК сустракаюцца на дзікарослых пасленовых з секцыі Anarrhicomenum ў Эквадоры, изоляты другой лініі распаўсюджаныя на бульбе, тамаце і дзікіх пасленовых. У Толука нават рэдкія гаплатыпы паходзяць толькі ад адной лініі, прычым генетычная варыябельнасць штамаў з Толука (нізкая алельных частата некаторых варыябельнасць сайтаў) сведчыць пра моцны эфекце заснавальніка ў выніку нядаўняга дрэйфу.
Акрамя таго, у Андах знойдзены новы від P. andina, марфалагічна і генетычна падобны з P. infestans, што, на думку аўтараў, паказвае на Анды, як на гарачую кропку відаўтварэння ў родзе Phytophthora. Нарэшце, у Еўропе і ў ЗША папуляцыі P. Infestans ўключаюць абедзве андскі лініі, у той час як у Толука - толькі адну.
Гэтая публікацыя выклікала рэакцыю ў адказ групы даследчыкаў з розных краін, якія правялі вялікую эксперыментальную работу па рэвізіі раней выкананага даследавання (Goss et al., 2014). У гэтай працы, па-першае, для даследавання палімарфізмам ДНК былі выкарыстаныя больш інфарматыўныя микросателлитные паслядоўнасці ДНК; па-другое, для аналізу кластарызацыі, шляхоў міграцыі часу разыходжанні папуляцый і інш. былі выкарыстаныя больш дасканалыя мадэлі (F-статыстыка, апраксімацыі Bayesian'a і інш.) і, па-трэцяе, скарыстана параўнанне не толькі з андскі выглядам P. andina, у якога была ўсталяваная гібрыдная прырода (P. infestans x Phytophthora sp.) , але і з мексіканскімі эндэмікамі P. mirabilis, P. Ipomoeae і Phytophthora phaseoli - генетычна блізкімі P. infestans, якія ўваходзяць у адну кладу (Kroon et al., 2012). У выніку гэтых аналізаў было адназначна паказана, што ядравая частка філагенетычнага дрэва ўсіх узятых у даследаванне відаў роду Phytophthora, акрамя гібрыднага P. andina, належыць мексіканскім штамам, а міграцыйны паток мае кірунак Мексіка - Анды, а не наадварот, і яго пачатак супадае з еўрапейскай каланізацыяй Новага Свету (300-600 гадоў назад). Такім чынам, узнікненне выгляду P. infestans, спецыялізаванага да паразы бульбы, адбылося ў другасным генетычным цэнтры фарміравання клубненосный пасленовых, г.зн. у Цэнтральнай Амерыцы.
Геном P. INFESTANS
У 2009 годзе міжнароднай групай навукоўцаў быў секвенирован поўны геном P infestans (Haas et al, 2009), памер якога склаў 240 Мб. Гэта ў некалькі разоў больш, чым у блізкіх відаў P. sojae (95 Мб), якія выклікаюць каранёвую гнілата соі, і P. Ramorum (65 Мб), якія паражаюць такія каштоўныя пароды дрэў, як дуб, бук і некаторыя іншыя. Атрыманыя дадзеныя паказалі, што геном змяшчае вялікую колькасць копій паўтаральных паслядоўнасцяў - 74%. У геноме вызначаны 17797 бялок-кадавальныя генаў, асноўную частку якіх складаюць гены, якія ўдзельнічаюць у клеткавых працэсах, уключаючы рэплікацыю ДНК, транскрыпцыю і трансляцыю бялкоў.
Параўнанне геномаў роду Phytophthora выявіла незвычайную арганізацыю геному, які складаецца з блокаў паслядоўнасцяў кансерватыўных генаў, у якіх шчыльнасць генаў адносна высокая, а ўтрыманне паўтаральных паслядоўнасцяў адносна нізка, і асобных абласцей з неконсервативными паслядоўнасцямі генаў, з нізкай шчыльнасцю генаў і высокім утрыманнем паўтаральных участкаў. Кансерватыўныя блокі складаюць 70% (12440) усіх кадавальныя бялок генаў P. infestans. У межах кансерватыўных блокаў гены, як правіла, размешчаны цесна з сярэднім межгенным адлегласцю 604 П.Н. У раёнах паміж кансерватыўнымі блокамі межгенное адлегласць больш (3700 П.Н.) з прычыны павелічэння шчыльнасці паўтаральных элементаў. Хутка эвалюцыянуюць эффекторные сакраторныя гены размешчаны ў раёнах з нізкім утрыманнем генаў.
Аналіз паслядоўнасцяў геному P. Infestans паказаў, што прыблізна адна траціна геному належыць да мабільных элементам. У геноме P. infestans утрымліваецца значна больш розных сямействаў транспозонов, чым у іншых вядомых геному. Большая частка транспозонов P. Infestans належыць сямейству Gypsy.
У геноме P. infestans выяўлена вялікая колькасць спецыфічных сямействаў генаў, якія ўдзельнічаюць у патагенезе. Значная іх частка кадуе эффекторные вавёркі, якія змяняюць фізіялогію расліны-гаспадара і спрыяюць яго інфікаванню. Яны ставяцца да двух вялікім катэгорыях: апопластические эффекторы, якія дзейнічаюць у міжцэлевых прасторах (апопластах) і цытаплазматычнай эффекторы, якія трапляюць у клеткі з дапамогай гаусторий. Апопластические эффекторы ўключаюць у сябе секретируемые гідралітычнай энзімы, такія як протеазы, ліпазы і гликозилазы, якія руйнуюць клеткі раслін; інгібітары энзімаў ахоўнай сістэмы расліны-гаспадара і некротизирующие таксіны, такія як Nep1 падобныя вавёркі (NPLs) і Pcf-падобныя невялікія вавёркі, багатыя цистеином (SCRs).
Эффекторные гены P. infestans шматлікія і звычайна большага памеру ў параўнанні з непатогенный генамі. Найбольш вядомыя цытаплазматычнай эффекторы RXLR і Crinkler (CNR). Тыповымі для оомицетов цытаплазматычная эффекторам з'яўляюцца RXLR вавёркі. Усе адкрытыя да гэтага часу гены RXLR эффектараў ўтрымліваюць амінакіс-тэрмінальную групу Arg-XLeu-Arg, дзе Х ўяўляе сабой амінакіслату. У выніку даследавання было выказана здагадка аб наяўнасці 563 RXLR генаў у геноме P. infestans, што на 60% больш, чым у P. sojae і P. ramorum. Прыблізна палова RXLR генаў у геноме P. infestans з'яўляюцца видоспецифичными. RXLR эффекторы адрозніваюцца вялікай разнастайнасцю паслядоўнасцяў. Сярод іх выяўленыя адно вялікае і 150 невялікіх сямействаў. У адрозненне ад асноўнага протеома, гены RXLR эффектараў звычайна размяшчаюцца ў абласцях геному, бедных генамі і багатых паўторамі. Мабільныя элементы, якія абумаўляюць дынамічнасць гэтых рэгіёнаў, спрыяюць рэкамбінацыі ў гэтых генах.
Цытаплазматычнай CRN эффекторы былі першапачаткова вызначаны ў транскрыптаў P. infestans, кадавальныя пептыды, якія выклікаюць некроз тканін расліны. З моманту іх адкрыцця было мала вядома аб сямействе гэтых эффектараў. Аналіз геному P. Infestans выявіў велізарнае сямейства з 196 CRN генаў, што значна больш, чым у P. sojae (100 CRN) і P. ramorum (19 CRN). Як і RXLR, CRN з'яўляюцца модульнымі вавёркамі і складаюцца з высока кансерватыўнага N-тэрмінальнага LFLAK дамена (50 амінакіслот) і побач размешчанага дамена DWL, які змяшчае розныя гены. Большасць CRN (60%) валодаюць сігнальным пептыдаў.
Была вывучана магчымасць розных CRN парушаць клеткавыя працэсы расліны-гаспадара. Пры аналізе некрозов расліны выдаленне CRN2 бялкоў дазволіла ідэнтыфікаваць С-канцавы рэгіён, які складаецца з 234 амінакіслот (пазіцыі 173-407, дамен DXG) і задзірлівы гібель клетак. Аналіз CRN-генаў P. infestans дазволіў выявіць чатыры розных С-канцавых рэгіёну, якія таксама выклікаюць гібель клетак ўнутры расліны. Да іх ставяцца ўпершыню пэўныя DC дамены (у P. Infestans 18 генаў і 49 псевдогенов), а таксама D2 (14 і 43) і DBF (2 і 1) дамены, якія валодаюць падабенствам з вавёркамі киназами. Вавёркі CRN-даменаў, экспрессируемые ў расліне, захоўваюцца (у адсутнасць сігнальных пептыдаў) у расліннай клетцы і стымулююць гібель клетак па ўнутрыклеткавага механізму. Яшчэ 255 змяшчаюць CRN-даменаў паслядоўнасцяў хутчэй за ўсё не функцыянуюць як гены.
Павелічэнне колькасці і памеру сямействаў эффекторных генаў RXLR і CRN было, як мяркуецца, абумоўлена, неаллельной гамалагічных рэкамбінацыяй і дубляваннем генаў. Нягледзячы на тое, што ў геноме ўтрымоўваецца вялікая колькасць актыўных мабільных элементаў, да гэтага часу няма прамых доказаў пераносу эффекторных генаў.
Метады, якія прымяняюцца пры вывучэнні структуры папуляцый
Вывучэнне генетычнай структуры папуляцый ў цяперашні час грунтуецца на аналізе чыстых культур ўваходзяць у яе штамаў. Аналіз папуляцый без вылучэння чыстых культур таксама праводзіцца з пэўнымі мэтамі, такімі, напрыклад, як вывучэнне агрэсіўнасці папуляцыі або прысутнасці ў ёй устойлівых да фунгіцыдамі штамаў (Філіпаў і інш., 2004 г., Деревягина і інш., 1999). Такі тып даследаванняў мяркуе выкарыстанне спецыяльных метадаў, апісанне якіх выходзіць за рамкі прапанаванага агляду. Для параўнальнага аналізу штамаў выкарыстоўваюць шэраг метадаў, заснаваных як на аналізе структуры ДНК, так і на вывучэнні фенатыпічнае праяў. Пры параўнальным аналізе папуляцый даводзіцца мець справу з вялікай колькасцю изолятов, што накладвае пэўныя патрабаванні на выкарыстоўваюцца метады. У ідэале яны павінны адпавядаць наступным патрабаванням (Cooke, Lees, 2004 г., Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- быць таннымі, нескладанымі ў выкананні, не патрабаваць значных часавых выдаткаў, грунтавацца на агульнадаступных тэхналогіях (напрыклад, ПЦР);
- павінны генераваць досыць вялікая колькасць незалежных кодоминантных маркерных прыкмет;
- мець высокую ўзнаўляльнасць;
- выкарыстоўваць мінімальная колькасць доследнай тканіны;
- быць спецыфічнымі да субстрату (наяўнае ў культуры забруджванне не павінна ўплываць на вынікі);
- не патрабаваць прымянення небяспечных працэдур і моцна таксічных хімікатаў.
Метадаў, якія адпавядаюць усім вышэйпералічаным параметрах, на жаль, не існуе. Для параўнальнага даследавання штамаў ў наш час выкарыстоўваюцца метады, заснаваныя на аналізе фенатыпічнае прыкмет: вірулентнасць да гатункаў бульбы і тамата (бульбяныя і таматавыя расы), тып спарвання, спектры изоферментов пептидазы і глюкоза-6-фосфатизомеразы, і на аналізе структуры ДНК: палімарфізм даўжынь рестрикционных фрагментаў (RFLP), які звычайна дапаўняюць гибридизационной пробай RG 57, аналіз микросателлитных паўтораў (SSR і InterSSR), амплификация са выпадковымі праймер (RAPD), амплификация рестрикционных фрагментаў (AFLP), амплификация з праймер, гамалагічных паслядоўнасцях мабільных элементаў (напрыклад, Inter SINE PCR), вызначэнне гаплатыпаў мітахандрыяльнай ДНК.
Кароткія апісанні метадаў параўнальнага даследавання штамаў, якія ўжываюцца ў працы з P. Infestans
Фенатыпічнае маркерная прыкметы
"Бульбяныя" расы
"Бульбяныя" расы ўяўляюць сабой часта доследны і які выкарыстоўваецца маркер. "Простыя бульбяныя" расы маюць адзін ген вірулентнасці да бульбы, "складаныя" - не менш за два. Black з суаўтарамі (1953), падагульняючы ўсё наяўныя ў іх дадзеныя, усталявалі, што раса фітафторы здольная тпоражать расліны з генам / генамі устойлівасці, адпаведныя гену / генам вірулентнасці P. infestans, і выявілі расы 1, 2, 3 і 4, якія дзівяць расліны з генамі R1, R2, R3 і R4, адпаведна, г.зн. ўзаемадзеянне паміж паразітам і гаспадаром адбываецца па прынцыпе "ген на ген". Далей Black пры ўдзеле Gallegly і Malcolmson адкрылі гены ўстойлівасці R5, R6, R7, R8, R9, R10 і R11 а таксама адпаведныя ім расы (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970 г.).
Па расавай складу ўзбуджальніка з розных рэгіёнаў існуе шырокі масіў дадзеных. Ня аналізуючы гэтыя дадзеныя падрабязна, пакажам толькі агульную тэндэнцыю: там, дзе выкарыстоўвалі гатункі з новымі генамі ўстойлівасці або іх камбінацыямі, спачатку мела месца некаторае паслабленне фітафтарозу, але затым з'яўляліся і адбіраліся расы з адпаведнымі генамі вірулентнасці і ўспышкі фітафтарозу аднаўляліся зноў. Спецыфічная вірулентнасць супраць першых 4 генаў устойлівасці (R1-R4) рэдка адзначалася ў калекцыях, сабраных да ўвядзення ў культуру гатункаў з гэтымі генамі, але колькасць вірулентныя штамаў рэзка павялічвалася пры Паразітаванне патогена на гатунках, апорных гэтыя гены. Гены 5-11, наадварот, сустракаліся ў калекцыях дастаткова часта (Shaw, 1991).
Даследаванне суадносін розных рас на працягу вегетацыйнага сезону, праведзенае ў канцы 1980-х гадоў, паказала, што ў пачатку развіцця захворвання ў папуляцыі пераважаюць клоны з нізкай агрэсіўнасцю і 1-2 генамі вірулентнасці.
Далей, па меры развіцця фітафтарозу, канцэнтрацыя зыходных клонаў памяншаецца і павялічваецца лік "складаных" рас з высокай агрэсіўнасцю. Встречаемості апошніх да канца сезона дасягае 100%. Пры захоўванні клубняў адбываецца памяншэнне агрэсіўнасці і страта асобных генаў вірулентнасці. Дынаміка замяшчэння клонаў можа адбывацца на розных гатунках па-рознаму (Рыбакова & Дзякаў, 1990). Аднак праведзеныя намі ў 2000-2010 гадах даследаванні паказалі, што складаныя расы сустракаюцца з самага пачатку эпифитотии сярод штамаў, выдзеленых як з бульбы, так і з тамата. Верагодна, гэта звязана са змяненнем папуляцый P. Infestans ў Расіі.
Да 1988-1995 гадах встречаемості "суперрас", якія маюць усе ці амаль усе гены вірулентнасці, у розных рэгіёнах дасягала 70-100%. Такая сітуацыя адзначалася, напрыклад, у Беларусі, у Ленінградскай, Маскоўскай абласцях, у Паўночнай Асеціі і ў Германіі (Іванюк і інш., 2002a, 2002b; Политыко, 1994.; Schober-Butin et al. 1995).
"Таматныя" расы
У гатункаў тамата атрымалася выявіць толькі 2 гена ўстойлівасці да фітафтарозу - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) і Ph2 (Al-Kherb, 1988). Як і ў выпадку з бульбянымі росамі, узаемадзеянне паміж таматамі і P. infestans адбываецца па прынцыпе "ген на ген". Раса T0 заражае гатунку, у якіх няма генаў устойлівасці (большасць прамыслова выкарыстоўваюцца гатункаў), раса Т1 заражае гатункі з геном Ph1 (Атава), раса Т2 - гатунку з генам Ph2.
У Расеі на бульбе выяўлялі амаль выключна Т0; на таматах ў пачатку сезона пераважала Т0, але пазней яна замяшчаць расой Т1 (Дзякаў і інш., 1975, 1994). Пасьля 2000 году Т1 на бульбе ў многіх папуляцыях стала сустракацца ў самым пачатку эпифитотии. У ЗША на бульбе сустракаліся штамы, непатогенный да таматы, а таксама расы Т0, Т1 і Т2, а на таматах пераважалі Т1 і Т2 (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al. 1995).
тып спарвання
Для правядзення даследавання неабходныя тестерные (рэферэнтныя) штамы з вядомымі тыпамі спарвання - А1 і А2. Доследны ізалят высейваецца з імі парамі ў кубкі Петры з аўсянай агаризованной асяроддзем. Пасля інкубацыі на працягу 10 дзён кубкі вывучаюць на наяўнасць або адсутнасць ооспор ў асяроддзі ў зоне кантакту штамаў. Магчымыя 4 варыянты: штам ставіцца да тыпу спарвання А1, калі ён утворыць ооспоры з тестеров А2, да А2, калі ўтварае ооспоры з тестеров А1, да А1А2, калі ўтварае ооспоры з абодвума тэстарамі, ці з'яўляецца стэрыльным (00), калі не ўтварае ооспор ні з адным тестеров (апошнія дзве групы сустракаюцца рэдка).
Для больш хуткага вызначэння тыпаў спарвання прадпрымаліся спробы выяўлення участкаў геному, звязаных з тыпам спарвання, з мэтай іх далейшага выкарыстання для вызначэння тыпу спарвання метадам ПЦР. Аднымі з першых паспяховы эксперымент па выяўленні падобнага ўчастка правялі амерыканскія даследчыкі (Judelson et al. 1995). З выкарыстаннем метаду RAPD яны змаглі ідэнтыфікаваць рэгіён W16, звязаны з тыпам спарвання ў нашчадкаў двух крыжаваліся изолятов, і сканструяваць пару 24-нуклеотидных праймер для яго амплификации (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') і W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 '). Пасля рэстрыкцыі ПЦР-прадукту з дапамогай рестриктазы HaeIII ўдавалася падзяліць изоляты з тыпамі спарвання А1 і А2.
Іншая спроба атрымаць ПЦР-маркеры для вызначэння тыпаў спарвання была прадпрынятая карэйскімі даследнікамі (Kim, Lee, 2002). Ідэнтыфікацыю спецыфічных прадуктаў яны праводзілі з выкарыстаннем метаду AFLP. У выніку была распрацавана пара праймер PHYB-1 (forward) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') і PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), якія дазваляюць выбарча амплифицировать ўчастак геному, звязаны з А2 тыпам спарвання. У далейшым яны працягнулі гэтую працу і сканструявалі праймер 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, forward) і 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), якія дазваляюць выбарча амплифицировать ўчастак Mat-A1, характэрны для штамаў з тыпам спарвання А1. Выкарыстанне ПЦР-дыягностыкі тыпаў спарвання паказала добрыя вынікі пры даследаванні папуляцый P. infestans ў Чэхіі (Mazakova et al., 2006), Тунісе (Jmour, Hamada, 2006) і іншых рэгіёнах. У нашай лабараторыі (Мыца, Еланский, не апублікавана) былі прааналізаваныя 34 штаму P. infestans, выдзеленыя з здзіўленых органаў бульбы і тамата ў розных рэгіёнах Расіі (Кастрамская, Разанская, Астраханская, Маскоўская вобласці). Вынікі ПЦР-аналізу з дапамогай спецыфічных праймер больш, чым на 90% супалі з вынікамі аналізу тыпу спарвання традыцыйным спосабам на пажыўнай асяроддзі.
Табліца 1. Варыябельнасць ўстойлівасці ўнутры клона Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Месца збору узораў | Колькасць прааналізаваных изолятов | Колькасць адчувальных (S), слабоустойчивых (SR) і ўстойлівых (R) штамаў, шт (%) | ||
S | SR | R | ||
Г. Уладзівасток | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
Г. Чыта | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Г. Іркуцк | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
Г. Краснаярск | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Г. Екацерынбург | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
О. Сахалін | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Омская вобл. | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Ўстойлівасць да металаксилу як папуляцыйны маркер
У пачатку 1980-х гадоў у самых розных рэгіёнах былі адзначаны магутныя ўспышкі фітафтарозу, выкліканыя устойлівымі да металаксилу штамамі P.infestans. Бульбаводчы гаспадаркі многіх краін панеслі адчувальныя страты (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Деревягина, 1991). З тых часоў у шматлікіх краінах свету вядзецца пастаянны маніторынг встречаемості устойлівых да фениламидным прэпаратаў штамаў ў папуляцыях P. infestans. Акрамя практычнай ацэнкі перспектыў прымянення фениламидсодержащих прэпаратаў, пабудовы сістэмы ахоўных мерапрыемстваў і прагназавання эпифитотий, ўстойлівасць да гэтых прэпаратаў стала адным з маркерных прыкмет, шырока выкарыстоўваюцца для параўнальнага аналізу папуляцый гэтага патогена. Аднак выкарыстанне ўстойлівасці да металаксилу ў параўнальных папуляцыйных даследаваннях варта праводзіць з улікам таго, што: 1 - генетычныя асновы ўстойлівасці яшчэ дакладна не вызначаны, 2 - устойлівасць да металаксилу - прыкмета селектыўна залежны, здольны змяняцца ў залежнасці ад прымянення фениламидов, 3 - зафіксаваныя розныя па ступені адчувальнасці да металаксилу штамы ўнутры адной клонально лініі (табл. 1).
спектры изоферментов
Изоферментные маркеры звычайна незалежныя ад знешніх умоў, паказваюць менделевской спадчыну і з'яўляюцца кодоминантными, якія дазваляюць адрозніваць гомо- і гетерозиготы. Выкарыстанне бялкоў як генных маркераў дазваляе выяўляць як буйныя рэарганізацыі генетычнага матэрыялу, уключаючы храмасомныя і геномныя мутацыі, так і адзінкавыя амінакіслотны замены.
Электрофоретические даследаванні бялкоў паказалі, што большасць ферментаў існуюць у арганізмах ў выглядзе некалькіх якія адрозніваюцца па электрофоретической рухомасці фракцый. Гэтыя фракцыі - вынік кадавання множных формаў ферментаў рознымі локусам (изозимы або изоферменты) або рознымі алеляў аднаго локуса (аллозимы або аллоферменты). Гэта значыць изозимы - гэта розныя формы аднаго фермента. Розныя формы маюць аднолькавую каталітычны актыўнасць, але трохі адрозніваюцца па адзінкавым амінакіслотным замену ў складзе пептыда і па зарадзе. Такія адрозненні выяўляюцца пры правядзенні электрафарэзу.
Пры даследаванні штамаў P. infestans выкарыстоўваюць спектры изоферментов двух бялкоў - пептидазы і глюкоза-6-фасфат изомеразы (гэты фермент ў расійскіх папуляцыях мономорфен, таму метады яго вывучэння ў дадзенай працы не прыводзяцца). Для іх падзелу на изозимы ў электрычным полі на пласціну геля, змешчаную ў электрычнае поле, наносяць бялковыя прэпараты, выдзеленыя з вывучаемых арганізмаў. Хуткасць дыфузіі ў гелі асобных бялкоў залежыць ад зарада і малекулярнай масы, таму ў электрычным полі адбываецца падзел сумесі бялкоў на асобныя фракцыі, якія можна візуалізаваць з дапамогай спецыяльных фарбавальнікаў.
Даследаванне изоферментов пептидазы праводзіцца на цэлюлозу-ацетатных, крухмальных або полиакриламидных гелях. Найбольш зручным з'яўляецца метад, заснаваны на выкарыстанні цэлюлозы-ацетатных геляў, якія вырабляюцца фірмай Helena Laboratories Inc. Ён не патрабуе вялікіх колькасцяў доследных матэрыялаў, дазваляе атрымліваць кантрасныя палосы на гелі пасля электрафарэзу для абодвух локусов фермента, яго правядзенне не патрабуе вялікіх часавых і матэрыяльных выдаткаў (мал. 2).
Невялікі кавалачак міцэліем пераносіцца ў микропробирку на 1,5 мл, да яго дадаецца 1-2 кроплі дыстыляванай вады. Пасля гэтага ўзор гомогенизируется (напрыклад, электродрелью з пластмасавай асадкай, прыдатнай да микропробирке) і абложваецца на працягу 25 секунд на цэнтрыфузе пры 13000 аб / мін. З кожнай микропробирки па 8 мкл. супернатант пераносіцца на плашчак аплікатара.
Цэлюлоза-ацетатных гель вымаюць з кантэйнера з буферам, змакаюць паміж двума лістамі фільтравальнай паперы і змяшчаюць рабочым пластом ўверх на пластмасавую базу аплікатара. Раствор з плашчакі пераносіцца аплікатарам на гель 2-4 разы. Гель перамяшчаюць у электрофорезную камеру,
Табліца 2. Склад раствора, які ўжываецца для афарбоўкі цэлюлозы-ацетатного геля пры аналізе изоферментов пептидазына край геля змяшчаюць кроплю фарбы (бромфеноловый сіні).
TRIS HCl, 0,05M, Ph 8,0 2 мл
Peroxidase, 1000 U / ml 5 кропель
o-dianisidine, 4 mg / ml 8 кропель
MgCl2, 20 mg / ml 2 кроплі
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 кропель
L-amino-acid oxidase, 20 u / ml 2 кроплі
Электрафарэз праводзіцца на працягу 20 мін. пры 200 В. Пасля электрафарэзу гель пераносіцца на фарбавальны столік і афарбоўваецца адмысловым фарбавальных растворам (табл. 2). 10 мл 1,6% DIFCO агара папярэдне растопліваюць у ЗВЧ печы, астуджаюць да 60 ° С, пасля чаго 2 ml агара змешваюць з фарбавальнай сумессю і выліваюць на гель. На працягу 15-20 мін праяўляюцца палоскі. Рэактыў L-amino-acid oxidase дадаюць непасрэдна перад змешваннем раствора з расплаўленым агаром.
У расійскіх папуляцыях локуса Рер 1 прадстаўлены генатыпам 100/100 і 92/100. Гомозигота 92/92 сустракаецца вельмі рэдка (каля 0,1%). Локуса Рер 2 прадстаўлены трыма генатыпам 100/100, 100/112 і 112/112, прычым усе 3 варыянту сустракаюцца досыць часта (Elanky, Smirnov, 2003 г., мал. 2).
даследаванні геному
Палімарфізм даўжынь рестрикционных фрагментаў з наступнай гібрыдызацыі (RFLP-RG 57)
Татальную ДНК апрацоўваюць рестриктазой Eco R1, фрагменты ДНК падзяляюць з дапамогай электрафарэзу ў агарозном гелі. Ядзерная ДНК вельмі вялікая і мае шмат паўтаральных паслядоўнасцяў, у сувязі з чым непасрэдны аналіз шматлікіх фрагментаў, атрыманых пад дзеяннем рестриктаз, праводзіць складана. Таму падзеленыя ў гелі фрагменты ДНК пераносяць на адмысловую мембрану і выкарыстоўваюць для гібрыдызацыі з зондам RG 57, у склад якога ўваходзяць нуклеатыдаў, пазначаныя радыеактыўнымі або флюарэсцэнтнага пазнакамі. Гэты зонд гибридизуется з шматкроць паўтараюцца паслядоўнасцямі геному (Goodwin et al., 1992 г., Forbes et al., 1998). Пасля візуалізацыі вынікаў гібрыдызацыі на святло- або радиоактивночувствительном матэрыяле атрымліваецца многолокусный профіль гібрыдызацыі (fingerprinting), прадстаўлены 25-29 фрагментамі (Forbes et al., 1998). Бясполае (клоновой) нашчадства будзе мець аднолькавыя профілі. Па размяшчэнні палос на электрофореграмме судзяць пра падабенства і адрозненні параўноўваных арганізмаў.
Гаплатыпы мітахандрыяльнай ДНК
У большасці эукарыятычнай клетак мтДНК прадстаўлена ў выглядзе двуцепочечной кальцавой малекулы ДНК, якая ў адрозненне ад ядзерных храмасом эукарыятычнай клетак реплицируется полуконсервативно і не звязаная з бялковымі малекуламі.
Мітахандрыяльнай геном P. infestans быў секвенирован, шэраг работ быў прысвечаны аналізу даўжынь рестрикционных фрагментаў (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Пасля таго як Griffith і Shaw (1998) распрацавалі нескладаны і хуткі метад вызначэння гаплатыпаў mtDNA, гэты маркер стаў адным з самых папулярных у даследаваннях P. Infestans Сутнасць метаду заключаецца ў паслядоўнай амплификации двух фрагментаў мітахандрыяльнай ДНК (з агульнага геному) праймер F2-R2 і F4-R4 (табл. 3) і іх наступнай рэстрыкцыі з дапамогай рестриктаз MspI (1-й фрагмент) і EcoR1 (2-й фрагмент). Метад дазваляе выдзеліць 4 гаплатыпу: Ia, IIa, Ib, IIb. Тып II адрозніваецца ад тыпу I прысутнасцю ўстаўкі памерам 1881 пн і іншым размяшчэннем сайтаў рэстрыкцыі ў рэгіёнах Р2 і Р4 (мал. 3).
Пачынаючы з 1996 года сярод штамаў, сабраных на тэрыторыі Расіі, адзначаліся толькі гаплатыпы Ia і IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Іх можна ідэнтыфікаваць пасля падзелу прадуктаў рэстрыкцыі з праймером F2-R2 ў электрычным полі (мал. 4, 5). Тыпы мтДНК выкарыстоўваюцца пры параўнальным аналізе штамаў і папуляцый. У шэрагу прац тыпы мітахандрыяльнай ДНК былі выкарыстаныя для выдзялення клонально ліній і пашпартызацыі изолятов P. infestans (Botez et al., 2007; Шэін і інш., 2009). Выкарыстоўваючы PCR-RFLP метад быў зроблены вывад аб гетэрагеннасць мтДНК у адным і тым жа штам P. infestans (Еланский, Мілюцін, 2007). Умовы амплификации: 1x (500 сек. 94 ° С), 40x (30 сек. 90 ° С, 30 сек. 52 ° С, 90 сек. 72 ° С); 1x (5 хв. 72 ° С). Рэакцыйная сумесь: (20 мкл): 0,2U Taq ДНК полимеразы, 1х 2,5 мм MgCl2-Taq-буфер, 0,2 мм кожны dNTP, 30 ПМ праймер і 5 НГ доследнай ДНК, деионизованная вада - да 20 мкл.
Рэстрыкцыяў ПЦР-прадукту праводзіцца на працягу 4-6 гадзін пры тэмпературы 37 ° С. Сумесь для рэстрыкцыі (20 мкл): 10x MspI (2 мкл), 10х буфер для рэстрыкцыі (2 мкл), деионизованная вада (6 мкл), ПЦР- прадукт (10 мкл).
Табліца 3. праймер, якія выкарыстоўваюцца для амплификации паліморфных рэгіёнаў mtDNA
локуса | праймер | Даўжыня праймер і яго размяшчэнне | Даўжыня ПЦР- прадукту | Рэстрыктаза |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21 г.; 13619-13639 гг | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22 г.; 14688-14667 гг | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22 г.; 9329-9350 гг | 964 | EcoRI |
R4: 5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22 г.; 10292-10271 гг |
Амплификация са выпадковымі праймер (RAPD)
Пры правядзенні RAPD выкарыстоўваюць адзін праймер (часам - некалькі праймер адначасова) з адвольнай паслядоўнасцю нуклеатыдаў, даўжынёй, як правіла, 10 нуклеатыдаў, з высокім утрыманнем (ад 50%) GC-нуклеатыдаў і нізкай тэмпературай адпалу (парадку 35ºС). Такія праймер «садзяцца» на шматлікія кампліментарныя сайты ў геноме. Пасля амплификации атрымліваецца вялікі лік ампликонов. Іх колькасць залежыць ад выкарыстоўванага праймер (праймер) і ўмоў рэакцыі (канцэнтрацыі MgCl2 і тэмпературы адпалу).
Візуалізацыю ампликонов праводзяць разгонкой ў полиакриламидном або агарозном гелі. Пры правядзенні RAPD аналізу неабходна старанна сачыць за чысцінёй аналізаванай матэрыялу, бо кантамінацыі іншымі жывымі аб'ектамі можа выклікаць значнае павелічэнне колькасці артэфактаў, якіх і пры аналізе чыстага матэрыялу даволі шмат (Perez et al, 1998). Выкарыстанне гэтага метаду пры даследаванні геному P. infestans адлюстравана ў шматлікіх працах (Judelson, Roberts, 1999 г., Ghimire et al., 2002 г., Carlisle et al., 2001). Падбор умоў рэакцыі і праймер (дасьледаваны 51 10-нуклеотидный праймер) прыведзены ў артыкуле Abu-El Samen et al., (2003).
Аналіз микросателлитных паўтораў (SSR)
Микросателлитные паўторы (simple sequence repeats, SSR) уяўляюць сабой тандэмнай паўтараюцца кароткія паслядоўнасці з 1-3 (часам да 6) нуклеатыдаў, прысутныя ў ядзерных геному ўсіх эукарыёт.Асноўныя. Колькасць наступных адзін за адным паўтораў можа вар'іраваць ад 10 да 100. Микросателлитные локуса сустракаюцца з досыць высокай частатой і больш-менш раўнамерна размеркаваны па ўсім геному (Lagercrantz et al., 1993). Палімарфізм микросателлитных паслядоўнасцяў звязаны з адрозненнямі ў ліку паўтораў базавага матыву. Микросателлитные маркеры ставяцца да кодоминантным, што дазваляе выкарыстоўваць іх для аналізу структуры папуляцыі, вызначэння сваяцтва, шляхоў міграцыі генатыпаў і да т.п. Сярод іншых добрых якасцяў гэтых маркераў варта адзначыць іх высокі палімарфізм, добрую ўзнаўляльнасць, нейтральнасць і магчымасць правядзення аўтаматычнага аналізу і ацэнкі Аналіз палімарфізму микросателлитных паўтораў ажыццяўляецца метадам ПЦР-амплификации з выкарыстаннем праймер, камплементарных унікальным паслядоўнасцях, фланкирующим микросателлитные локуса. Першапачаткова аналіз праводзілі з падзелам прадуктаў рэакцыі на полиакриламидном гелі. Пазней супрацоўнікамі кампаніі Applied Biosystems было прапанавана выкарыстоўваць флуоресцентные пазначаныя праймер з дэтэкцыі прадуктаў рэакцыі пры дапамозе аўтаматычнага лазернага дэтэктара (Diehl et al., 1990), а затым і стандартных аўтаматычных ДНК-секвенаторов (Ziegle et al., 1992). Мечаных праймер рознымі флюарысцэнтнымі фарбавальнікамі дазваляе аналізаваць адразу некалькі маркераў на адной дарожцы і, адпаведна, істотна павялічыць прадукцыйнасць метаду і павысіць дакладнасць аналізу.
Першыя публікацыі, прысвечаныя выкарыстанню SSR аналізу для даследавання P. infestans, з'явіліся ў пачатку 2000 гг. (Knapova, Gisi, 2002). Не ўсе прапанаваныя аўтарамі маркеры паказалі дастатковую ступень палімарфізму, аднак два з іх (4B і G11) былі ўключаныя ў набор з 12 SSR-маркераў, прапанаваны ў працы Lees і інш. (2006) і пасля прыняты ў даследчай сеткі Eucablight (www.eucablight .org) у якасці стандарту для P. infestans. Праз некалькі гадоў было апублікавана даследаванне, прысвечанае стварэнню сістэмы мультыплекснай аналізу ДНК P. infestans на аснове васьмі SSR-маркераў (Li et al., 2010). Нарэшце, пасля правядзення ацэнкі ўсіх прапанаваных раней маркераў і адбору найбольш інфарматыўных з іх, а таксама ажыццяўлення аптымізацыі праймер, флуоресцентных пазнак і ўмоў амплификации, гэты ж калектыў аўтараў прадставіў сістэму аднастадыйная мультыплекснай аналізу, якая ўключае 12 маркераў (табл. 4; Li et al. , 2013a). Якія выкарыстоўваюцца ў гэтай сістэме праймер былі падабраныя і пазначаныя адным з чатырох флуоресцентных маркераў (FAM, VIC, NED, PET) такім чынам, каб дыяпазоны памераў алеляў праймер з аднолькавымі пазнакамі ня перакрываліся.
Аўтары праводзілі аналіз на амплификаторе PTC200 (MJ Research, ЗША) з выкарыстаннем набораў QIAGEN multiplex PCR або QIAGEN Typeit Microsatellite PCR. Аб'ём рэакцыйнай сумесі складаў 12.5 мкл. Умовы амплификации былі наступнымі: для QIAGEN multiplex PCR: 95ºС (15 мін), 30х (95ºС (20 с), 58ºС (90 с), 72ºС (60 с), 72ºС (20 мін); для QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95ºС (5 мін), 28х (95ºС (30 с), 58ºС (90 с), 72ºС (20 с), 60ºС (30 мін).
Падзел і візуалізацыю ПЦР-прадуктаў ажыццяўлялі з выкарыстаннем аўтаматычнага капілярнага ДНК-аналізатара ABI3730 (Applied Biosystems).
Табліца 4. Характарыстыкі 12 стандартных SSR-маркераў, якія выкарыстоўваюцца для генотипирования P. Infestans (Li et al., 2013a)
Назва | Кол-у алеляў | дыяпазон памеру алеляў (П.Н.) | праймер |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Прыклад візуалізацыі вынікаў аналізу паказаны на мал. 6. Вынікі аналізавалі пры дапамозе праграмы GeneMapper 3.7 шляхам параўнання атрыманых дадзеных з дадзенымі вядомых изолятов. Для палягчэння інтэрпрэтацыі вынікаў аналізу ў кожнае даследаванне неабходна ўключаць 1-2 рэферэнтных изолята з вядомым генатыпам.
Прапанаваны метад даследавання быў пратэставаны на значнай колькасці палявых узораў, пасля чаго аўтары ажыццявілі стандартызацыю пратаколаў паміж лабараторыямі дзвюх арганізацый, The James Hutton Institute (Вялікабрытанія) і Wageningen University & Research (Нідэрланды), што, разам з магчымасцю выкарыстання стандартных FTA-карт для спрошчанага збору і перасылкі узораў ДНК P. infestans, дазволіла казаць аб магчымасці камерцыйнага выкарыстання гэтай распрацоўкі. Акрамя таго, хуткі і дакладны метад генотипирования изолятов P. Infestans з выкарыстаннем мультыплекснай SSR-аналізу забяспечыў магчымасць правядзення стандартызаваных даследаванняў папуляцый дадзенага патогена ў глабальных маштабах, а стварэнне сусветнай базы дадзеных па фітафторы ў рамках праекта Eucablight (www.eucablight.org), у якую ўваходзяць , у тым ліку, вынікі микросателлитного аналізу, дазволіла адсочваць з'яўленне і распаўсюджванне новых генатыпаў ва ўсім свеце.
Палімарфізм даўжынь амплифицированных рестрикционных фрагментаў (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) - тэхналогія атрымання выпадковых малекулярных маркераў з выкарыстаннем спецыфічных праймер. Пры AFLP ДНК апрацоўваюць камбінацыяй з двух рестриктаз. Спецыфічныя адаптары лигируют з "ліпкімі" канцамі рестрикционных фрагментаў.
Затым гэтыя фрагменты амплифицируют, выкарыстоўваючы праймер, камплементарныя паслядоўнасці адаптара і сайту рэстрыкцыі, і апорныя дадаткова адно або больш выпадкова выбраных падстаў на іх 3'-канцах. Набор атрыманых фрагментаў залежыць ад рестриктаз і выпадкова выбраных нуклеатыдаў на 3'-канцах праймер (Vos et al. 1995). AFLP -генотипирование ўжываюць для хуткага вывучэння генетычнай зменлівасці розных арганізмаў.
Падрабязнае апісанне метаду прыведзена ў працах Mueller, Wolfenbarger 1999, Savelkoul et al., 1999. Вялікая работа, якая дазваляе параўнаць дазвол метадаў AFLP і SSR, была праведзена кітайскімі исследователяими. Былі вывучаны фенатыпічнае і Генатыпічная асаблівасці 48 изолятов P. infestans, сабраныя ў пяці галінах Паўночнага Кітая. Па AFLP- спектрах было выяўлена восем розных генатыпаў ДНК, у адрозненне ад SSR- генатыпаў, па якіх разнастайнасці выяўлена не было (Guo et al., 2008).
Амплификация з праймер, гамалагічных паслядоўнасцях мабільных элементаў
Маркеры, атрыманыя на аснове паслядоўнасцяў ретротранспозонов, вельмі зручныя для генетычнага карціравання, вывучэння генетычнага разнастайнасці і працэсаў эвалюцыі (Schulman, 2006). Калі зрабіць праймер, кампліментарныя стабільным паслядоўнасцях тых ці іншых мабільных элементаў, можна амплифицировать ўчасткі геному, якія знаходзяцца паміж імі. У даследаваннях ўзбуджальніка фітафтарозу паспяхова прымяняўся метад амплификации участкаў геному з дапамогай праймер, кампліментарнай каровай паслядоўнасці ретропазона SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) (Лаўрова, Еланский 2003). З дапамогай дадзенага метаду выяўляліся адрозненні нават у бясполым нашчадства аднаго изолята. У сувязі з гэтым быў зроблены вывад аб высокай спецыфічнасці метаду інтэр - SINE - ПЦР і высокай хуткасці перамяшчэння SINE - элементаў у геноме Phytophthora.
У геноме P. infestans выяўлена 12 сямействаў кароткіх ретротранспозонов (SINEs); даследавана краявідная размеркаванне кароткіх ретротранспозонов, выяўлены элементы (SINEs), якія сустракаюцца ў геноме толькі P. infestans (Лаўрова, 2004).
Асаблівасці прымянення метадаў параўнальнага даследавання штамаў ў папуляцыйных даследаваннях
Пры планаванні даследаванні трэба выразна ўяўляць мэты, якія яно мае на, і выкарыстоўваць адпаведныя метады. Так, некаторыя метады дазваляюць генераваць вялікая колькасць незалежных маркерных прыкмет, але пры гэтым маюць нізкую ўзнаўляльнасць і моцна залежаць ад выкарыстоўваных рэактываў, умоў рэакцыі, забруджанасці доследнага матэрыялу. Таму ў кожным даследаванні групы штамаў неабходна выкарыстоўваць некалькі стандартных (рэферэнтных) изолятов, але нават і ў гэтым выпадку вынікі некалькіх эксперыментаў вельмі складана аб'яднаць.
Да гэтай групы метадаў можна аднесці RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Пасля амплификации атрымліваецца вялікі лік фрагментаў ДНК рознага памеру. Падобныя методыкі мэтазгодна выкарыстоўваць у выпадку неабходнасці ўстанаўлення адрозненняў паміж блізкароднаснымі штамамі (бацькі-нашчадкі, дзікі тып-мутанты, і г.д), або ў выпадках, калі неабходны дэталёвы аналіз невялікі выбаркі. Так, метад AFLP шырока выкарыстоўваецца пры генетычным карціравання P. infestans (van der Lee et al., 1997) і пры унутрыпапуляцыйных даследаваннях (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Такія метады немэтазгодна выкарыстоўваць пры стварэнні баз дадзеных штамаў, бо практычна немагчыма ўніфікаваць ўлік вынікаў пры правядзенні аналізаў у розных лабараторыях.
Пры ўяўнай прастаце і шпаркасці выканання (вылучэнне ДНК без добрай ачысткі, амплификация, візуалізацыя вынікаў) гэтая група метадаў патрабуе прымянення спецыяльнага метаду дакументавання вынікаў: разгонки ў полиакриламидном гелі з пазначанымі (радыеактыўна або люмінісцэнтныя) праймер і наступнай засвятлення святло- або радиоактивночувствительного матэрыялу. Звычайны метад візуалізацыі ў агарозном гелі з бромісты этидием для гэтых метадаў, як правіла, непрыдатны, бо вялікі лік фрагментаў ДНК рознага памеру можа злівацца.
Іншыя метады, наадварот, дазваляюць генераваць малы лік прыкмет пры іх вельмі высокай узнаўляльнасці. Да гэтай групы можна аднесці даследаванне гаплатыпаў мітахандрыяльнай ДНК (у Расіі адзначаны толькі два гаплатыпу Ia і IIa), тыпу спарвання (большасць изолятов падпадзяляюцца на 2 тыпу: А1 і А2, рэдка сустракаюцца самофертильные SF) і спектраў изоферментов пептидазы (два локуса Pep1 і Pep2 , якія складаюцца з двух изозимов кожны) і глюкоза-6-фасфат изомеразы (у Расіі варыябельнасці па гэтай прыкмеце няма, хоць у іншых краінах свету адзначаецца значны палімарфізм). Гэтыя прыкметы мэтазгодна выкарыстоўваць пры аналізе калекцый, складанні баз дадзеных рэгіянальнага і сусветнага маштабу. У выпадку аналізу изоферментов игаплотипов мітахандрыяльнай ДНК можна абыйсціся наогул без стандартных штамаў, у той час як пры аналізе тыпаў спарвання неабходна два тестерных изолята з вядомымі тыпамі спарвання.
Умовы рэакцыі і рэактывы могуць уплываць толькі на кантраснасць прадукту на электрофореграмме, праява артэфактаў у гэтых відах даследаванняў малаверагодна.
У цяперашні час большасць папуляцый ў еўрапейскай часткі Расіі прадстаўлены штамамі абодвух тыпаў спарвання (табл. 6), сярод іх сустракаюцца изоляты з Ia і IIa тыпамі мітахандрыяльнай ДНК (іншыя тыпы mtDNA, якія сустракаюцца ў свеце, у Расіі пасля 1993 гады ня выяўляліся). Спектры изоферментов пептидазы прадстаўлены двума генатыпу па локусу Pep1 (100/100, 92/92 і гетерозигота 92/100, прычым генатып 92/92 сустракаецца вельмі рэдка (<0,3%)) і двума генатыпу па локусу Pep 2 (100/100 , 112/112 і гетерозигота 100/112, прычым генатып 112/112 сустракаецца радзей 100/100, але таксама досыць часта).
Варыябельнасці спектру изоферментов глюкоза-6- фасфат изомеразы пасля 1993 года (знікненне клонально лініі US-1) не адзначана, усе даследаваныя изоляты мелі генатып 100/100 (Elansky, Smirnov, 2002).
Трэцяя група метадаў дазваляе атрымаць дастатковую групу незалежных маркерных прыкмет пры высокай узнаўляльнасці. На сённяшні дзень да гэтай групы можна аднесці пробу RFLP-RG57, пры выкарыстанні якой атрымліваецца 25-29 фрагментаў ДНК рознага памеру. Выкарыстоўваць RFLP-RG57 можна як пры аналізе выбарак, так і пры складанні баз дадзеных. Аднак гэты метад значна даражэй папярэдніх, патрабуе вялікіх часавых выдаткаў, для яго правядзення неабходна досыць вялікая колькасць ДНК высокай ачысткі. Таму даследчык вымушаны абмяжоўваць аб'ём тэставага матэрыялу.
Распрацоўка RFLP-RG57 ў пачатку 90-х гадоў мінулага стагоддзя істотна актывізавала папуляцыйныя даследаванні ўзбуджальніка фітафтарозу. Ён стаў асновай метаду, заснаванага на вылучэнні і аналізе «клонально ліній» (гл. Ніжэй). Нароўні з RFLP-RG57 для ідэнтыфікацыі клонально ліній ужываюць тып спарвання, фингерпринтинг ДНК (метад RFLP-RG57), спектры изоферментов пептидазы і глюкоза-6-фосфатизомеразы і тып мітахандрыяльнай ДНК. Дзякуючы яму было паказана al., 1994), змена старых папуляцый новымі (Drenth et al, 1993 годзе, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), выяўлены клонально лініі, пераважныя ў многіх краінах свету. Даследаванні расійскіх штамаў з выкарыстаннем гэтага метаду паказала высокі Генатыпічная палімарфізм штамаў Еўрапейскай часткі і мономорфизм папуляцый Азіяцкай і Далёкаўсходняй частак Расіі (Elansky et al, 2001). І зараз гэты метад застаецца асноўным пры правядзенні папуляцыйных даследаванняў P. infestans. Аднак шырокаму яго распаўсюджванню перашкаджаюць даволі высокі кошт і працаёмкасць ў выкананні.
Іншым перспектыўным метадам, шырока рэдка выкарыстоўваным у даследаваннях P. infestans, з'яўляецца аналіз микросателлитных паўтораў (SSR). У цяперашні час гэты метад щироко выкарыстоўваецца для вылучэння клонально ліній. Для аналізу штамаў шырока выкарыстоўваліся (і працягваюць выкарыстоўвацца) такія фенатыпічнае маркерная прыкметы, як наяўнасць генаў вірулентнасці да гатункаў бульбы (Аўдзей 1995, Іванюк і інш., 2002 г., Уланава і інш., 2003 г.) і тамата. Да цяперашняга часу гены вірулентнасці да гатункаў бульбы страцілі сваю каштоўнасць як маркерная прыкметы для папуляцыйных даследаванняў у сувязі са з'яўленнем максімальнага (ці блізкага да яго) ліку генаў вірулентнасці ў пераважнай большасці изолятов. У той жа час ген вірулентнасці Т1 да гатункаў тамата, якія нясуць адпаведны ген Ph1, да гэтага часу паспяхова выкарыстоўваецца ў якасці маркерная прыкметы (Лаўрова і інш., 2003 г., Уланава і інш., 2003 г.).
У многіх працах у якасці маркерная прыкметы выкарыстоўваецца ўстойлівасць да фунгіцыдамі. Гэты прыкмета непажадана выкарыстоўваць у папуляцыйных даследаваннях у сувязі з досыць лёгкім з'яўленнем мутацый ўстойлівасці ў клонально лініях пасля прымянення металаксил- (або мефеноксам-) змяшчаюць фунгіцыдаў на полі. Напрыклад, істотныя адрозненні па ўзроўні ўстойлівасці паказаны ўнутры клонально лініі Sib1 (Elansky et al., 2001).
Такім чынам, пераважнымі маркерная прыкметамі для стварэння банкаў даных і маркіравання штамаў ў калекцыях з'яўляюцца тып спарвання, спектр изоферментов пептидазы, тып мітахандрыяльнай ДНК, RFLP-RG57, SSR. Для параўнання абмежаваных выбарак, пры неабходнасці прымянення максімальнага ліку маркерных прыкмет, можна выкарыстоўваць AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (табл. 5). Аднак варта памятаць, што гэтыя метады слабовоспроизводимы, і ў кожным асобным эксперыменце (цыкле амплификация электрафарэз) неабходна выкарыстоўваць некалькі рэферэнтных изолятов.
Табліца 5. Параўнанне розных метадаў даследавання штамаў П. Інфэстанс
крытэрый | МС | Изофер мянты | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | МССР | SSR | AFLP | абарот |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
колькасць інфармацыі | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Прайгравальнасць | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
магчымасць артэфактаў | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Кошт | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
працаёмкасць | Н | Н | Н | В | НС * | НС * | Н | С | НС * |
Хуткасць правядзення аналізу ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Заўв .: Н - нізкая, З - сярэдняя, У - высокая; НС * - працаёмкасць нізкая пры выкарыстанні агарозного геля або аўтаматычнага
генотайпера, сярэдняя - пры разгонке ў полиакриламидном гелі з пазначанымі праймер,
** - не лічачы выдаткаў часу на нарошчванне міцэліем для вылучэння ДНК.
структура папуляцый
клонально лініі
У адсутнасці рэкамбінацыі або пры нязначным яе укладзе ў папуляцыйных структуру папуляцыя складаецца з пэўнай колькасьці клонаў, генетычныя абмены паміж якімі вельмі рэдкія.
У такіх папуляцыях больш інфарматыўна вывучэнне ня частот асобных генаў, а частот генатыпаў, якія маюць агульнае паходжанне (клонально ліній або clonal lineages) і адрозніваюцца толькі кропкавымі мутацыямі. Папуляцыйныя даследаванні ўзбуджальніка фітафтарозу і аналіз клонально ліній істотна паскорыліся пасля з'яўлення метаду RFLP-RG57 ў пачатку 90-х гадоў мінулага стагоддзя. Нароўні з RFLP-RG57, для ідэнтыфікацыі клонально ліній выкарыстоўваюць тып спарвання, спектры изоферментов пептидазы і глюкоза-6-фосфатизомеразы, тып мітахандрыяльнай ДНК. Характарыстыка найбольш часта сустракаемых клонально ліній прыведзена ў табліцы 6.
Клон US-1 паўсюдна дамінаваў у папуляцыях да канца 80-х гадоў ХХ стагоддзя, пасля чаго стаў замяняцца іншымі клонамі і знік з Еўропы і Паўночнай Амерыкі. Цяпер ён сустракаецца на Далёкім Усходзе (Філіпіны, Тайвань, Кітай, Японія, Карэя, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), у Афрыцы (Уганда, Кенія, Руанда, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al., 2000.; Ochwo et al., 2002) і ў Паўднёвай Амерыцы (Эквадор, Бразілія, Перу, Forbes et al., 1997, Goodwin et al, 1994). Не было ідэнтыфікавана штамаў, якія належаць да лініі US-1 толькі ў Аўстраліі. Па-відаць, у Аўстралію изоляты P. infestans патрапілі з другога хваляй міграцыі (Goodwin, 1997).
Клон US-6 міграваў з Паўночнай Мексікі ў Каліфорнію ў канцы 70-х гадоў і выклікаў там эпідэмію на бульбе і таматах пасля 32 гадоў адсутнасці хваробы. У сувязі з высокай агрэсіўнасцю ён выцесніў клон US-1 і стаў дамінаваць на заходнім узбярэжжы ЗША (Goodwin et al., 1995a).
Генатыпы US-7 і US-8 былі выяўленыя ў ЗША ў 1992 г і ўжо ў 1994 г шырока распаўсюдзіліся ў ЗША і Канадзе. На працягу аднаго палявога сезона клон US-8 здольны амаль цалкам выцесніць клон US-1 на бульбяных дзялянках, зыходна заражаных абодвума клонамі ў роўнай канцэнтрацыі (Miller, Johnson, 2000).
Клоны ВС-1 - ВС-4 былі выяўлены ў Брытанскай Калумбіі ў невялікага ліку изолятов Goodwin et al., 1995b). Клон US-11 шырока распаўсюдзіўся ў ЗША і выцесніў US-1 на Тайвані. Клоны JP-1 і ЕС-1, нароўні з клонам US-1, распаўсюджаныя ў Японіі і Эквадоры, адпаведна (Koh et al., 1994.; Forbes et al., 1997).
SIB-1 - клон, пераважае ў Расіі на велізарнай тэрыторыі ад Маскоўскай вобласці да Сахаліна. У Маскоўскай вобласці ён быў знойдзены ў 1993 г., прычым некаторыя палявыя папуляцыі складаліся пераважна з штамаў гэтай клонально лініі, высокоустойчивых да металаксилу. Пасьля 1993 г. распаўсюджанасць гэтага клона істотна знізілася. За Уралам ў 1997-1998 гадах SIB-1 сустракаўся паўсюдна за выключэннем Хабараўскага краю (там распаўсюджаны клон SIB-2). Прасторавае падзел клонаў, якія маюць розныя тыпы спарвання, выключае палавой працэс на тэрыторыі Сібіры і Далёкага Усходу. У Маскоўскай вобласці, у адрозненне ад Сібіры, папуляцыя прадстаўлена мноствам клонаў; амаль кожны ізалят мае унікальны мультилокусный генатып (Elansky et al., 2001, 2015). Гэта разнастайнасць нельга растлумачыць толькі завозам штамаў грыба з розных раёнаў свету з імпартуемым насенным матэрыялам. Паколькі ў папуляцыі сустракаюцца абодва тыпу спарвання, магчыма, яе разнастайнасць абумоўлена таксама рэкамбінацыяй. Так, у Брытанскай Калумбіі мяркуецца ўзнікненне генатыпаў ВС-2, ВС-3 і ВС-4 прычыны гібрыдызацыі клонаў ВС-1 і US-6 (Goodwin et al., 1995b). Магчыма, і ў Маскоўскіх папуляцыях сустракаюцца гібрыдныя штамы. Напрыклад, гетерозиготные па РЕР-локусу штамы МО-4, МО-8 і МО-11 могуць быць гібрыдамі паміж штамамі МО-12, МО-21, МО-22, якія маюць тып спарвання А2 і гомозиготными па адной алелі РЕР-локуса і штамам МО-8, якія маюць тып спарвання А1 і гомозиготным па іншай алеляў локуса. А калі гэта так, і ў сучасных папуляцыях P. infestans маецца тэндэнцыя да ўзмацнення ролі палавога працэсу, то інфармацыйнае значэнне аналізу мультилокусных клонаў будзе падаць (Elansky et al., 2001, 2015).
Зменлівасць у клонально лініях
Да 90-х гадоў 20 стагоддзя ў свеце была шырока распаўсюджана клонально лінія US-1. Большасць палявых і рэгіянальных папуляцый складаліся выключна з штамаў з генатыпам US-1. Аднак пры гэтым назіраліся і адрозненні паміж изолятами, выкліканыя, хутчэй за ўсё, мутацыйных працэсам. Мутацыі адбываліся як у ядзернай, так і ў мітахандрыяльнай ДНК і закраналі у тым ліку ўзровень устойлівасці да фениламидным прэпаратаў і лік генаў вірулентнасці. Лініі, адрозныя ад зыходных генатыпаў мутацыямі, абазначаюцца дадатковымі лічбамі пасля кропкі, наступнай за назвай зыходнага генатыпу (напрыклад, мутантных лінія US-1.1 клонально лініі US-1). Фингерпринтинги ДНК лініі US-1.5 і US-1.6 ўтрымліваюць дадатковыя лініі рознага памеру (Goodwin et al., 1995a, 1995b); клонально лінія US-6.3 таксама адрозніваецца ад US-6 адной дадатковай лініяй (Goodwin, 1997, табл. 7).
Пры даследаванні мітахандрыяльнай ДНК высветлілася, што ў клонально лініі US-1 сустракаецца толькі 1b тып мітахандрыяльнай ДНК (Carter et al., 1990). Аднак пры даследаванні штамаў гэтай клонально лініі з Перу і Філіпін былі адзначаны изоляты, тыпы мітахандрыяльнай ДНК якіх оличались ад 1b наяўнасцю уставак і дзялок (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Табліца 6. Мультилокусные генатыпы некаторых клонально ліній P. Infestans
Назва | тып спарвання | Ізаферменты | Фінгерпрынты ДНК | тып MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
ЗША 1 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
ЗША 2 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
ЗША 3 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
ЗША 4 | А1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
ЗША 5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
ЗША 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
ЗША 7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
ЗША 8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
ЗША 9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
ЗША 10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
ЗША 11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
ЗША 12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
ЗША 14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
ЗША 15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
ЗША 16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
ЗША 17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
ЗША 18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
ЗША 19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
СІБ-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
СІБ-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
СІБ-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Заўв .: * - няма дадзеных.
Табліца 7. Мультилокусные генатыпы і іх мутантавыя лініі
Назва | тып спарвання | | Фінгерпрынты ДНК (RG57) | Заўвагі | |
GPI | ПЭП-1 | ||||
ЗША 1 | А1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Зыходны генатып 1 |
ЗША 1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Мутацыя ў PEP |
ЗША 1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Мутацыя ў RG57 |
ЗША 1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Мутацыя ў RG57 |
ЗША 1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Мутацыя ў RG57 і РЕР |
ЗША 1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Мутацыя ў RG57 |
ЗША 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Зыходны генатып 2 |
ЗША 6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Мутацыя ў PEP |
ЗША 6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Мутацыя ў RG57 |
ЗША 6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Мутацыя ў RG57 |
ЗША 6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Мутацыя ў RG57 і РЕР |
ЗША 6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Мутацыя ў RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Зыходны генатып 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Мутацыя ў RG57 |
Таксама сустракаюцца змены ў спектрах изоферментов. Як правіла, яны выкліканы распадам зыходна гетерозиготного па гэтым ферментаў арганізма на гомозиготные. У 1993 годзе на плёне тамата намі быў ідэнтыфікаваны штам з характэрнымі для US-1 прыкметамі: фингерпринтингом RG57, тыпам мітахандрыяльнай ДНК і генатыпам 86/100 па глюкоза-6-фосфатизомеразе, але ён быў гомозиготен (100/100) па першым локусу пептидазы замест тыповай для гэтай клонально лініі гетерозиготы 92/100. Генатып гэтага штаму мы назвалі МО-17 (табл. 6). Мутантавыя лініі US-1.1 і US-1.4 таксама адрозніваюцца ад US-1 мутацыямі ў першым локуса пептидазы (табл. 7).
Мутацыі, вядучыя да зменаў ліку генаў вірулентнасці да гатункаў бульбы і тамата сустракаюцца даволі часта. Яны былі адзначаны сярод изолятов клонально лініі US-1 у папуляцыях з Нідэрландаў (Drenth et al., 1994), Перу (Goodwin et al., 1995a), Польшчы (Sujkowski et al., 1991), поўначы Паўночнай Амерыкі (Goodwin et al ., 1995b). Адрозненні ў ліку генаў вірулентнасці да бульбы таксама былі адзначаны сярод изолятов клонально ліній US-7 і US-8 у Канадзе і ЗША (Goodwin et al., 1995a), сярод изолятов лініі SIB-1 у Азіяцкай часткі Расіі (Elansky et al 2001 ).
Изоляты, якія маюць моцныя адрозненні ў узроўнях ўстойлівасці да фениламидным прэпаратаў, былі ідэнтыфікаваныя ў моноклональных палявых папуляцыях, усе штамы у якіх належалі да клонально лініі Sib-1 (Elansky et al, 2001, табл. 1). Амаль усе штамы клонально лініі US-1 адрозніваюцца высокай адчувальнасцю да металаксилу, аднак высокоустойчивые изоляты гэтай лініі былі вылучаныя на Філіпінах (Koh et al., 1994) і ў Ірландыі (Goodwin et al., 1996).
Сучасныя папуляцыі P. Infestans
Цэнтральная Амэрыка (Мексіка)
Папуляцыя P. infestans ў Мексіцы прыкметна адрозніваецца ад іншых сусветных папуляцый, што звязана, у першую чаргу, з яе гістарычным становішчам. Шматлікія даследаванні гэтай папуляцыі і роднасных P. infestans відаў скарбы Phytophthora, а таксама мясцовых відаў роду Solanum, дазволілі зрабіць выснову аб тым, што эвалюцыя патогена ў цэнтральнай частцы Мексікі адбывалася сумесна з эвалюцыяй раслін-гаспадароў і была звязана з палавой рэкамбінацыяй (Grünwald, Flier , 2005). У папуляцыі прадстаўлены абодва тыпу спарвання, прычым у роўнай суадносінах, а прысутнасць ооспор ў глебе, на раслінах і клубнях бульбы і дзікарослых роднасных відаў Solanum пацвярджае наяўнасць у папуляцыі палавога працэсу (Fernández-Pavía et al., 2002). Нядаўна праведзеныя даследаванні даліны Толука і яе наваколляў (меркаваны цэнтр паходжання патогена) пацвердзілі высокую генетычнае разнастайнасць мясцовай папуляцыі P. infestans (134 мультилокусных генатыпу у выбарцы з 176 узораў) і наяўнасць у рэгіёне некалькіх дыферэнцыраваных субпапуляцый (Wang et al., 2017). Фактарамі, спрыяльнымі такой дыферэнцыяцыі, з'яўляюцца прасторавае падзел субпапуляцый, характэрнае для гарыстай мясцовасці цэнтральнай Мексікі, адрозненні ва ўмовах культывацыі і гатунках бульбы, якія выкарыстоўваюцца ў далінах і гарах, а таксама наяўнасць дзікарослых клубненосный відаў Solanum, здольных выступаць у якасці альтэрнатыўных гаспадароў (Fry et al ., 2009).
Варта, аднак, адзначыць, што папуляцыі P. Infestans ў Паўночнай Мексіцы носяць хутчэй клонально характар і больш падобныя на паўночнаамерыканскія папуляцыі, што, магчыма, кажа пра тое, што менавіта новых генатыпаў (Fry et al., 2009).
Паўночная Амерыка
Паўночнаамерыканскія папуляцыі P. Infestans заўсёды адрозніваліся вельмі просты структурай і іх клонально характар быў усталяваны задоўга да пачатку прымянення микросателлитного аналізу. Аж да 1987 г. на тэрыторыі ЗША і Канады дамінавала клонально лінія US-1 (Goodwin et al. 1995). У сярэдзіне 70-х гг, калі з'явіліся фунгіцыды на аснове металаксила, гэты клон пачаў выцясняцца іншымі, больш устойлівымі генатыпаў, мігравалі з Мексікі (Goodwin et al., 1998). Да канца 90-х гг. генатып US-8 цалкам выцесніў ў ЗША генатып US-1 і стаў дамінуючай клонально лініяй на бульбе (Fry et al. 2009; Fry et al., 2015). Іншая сітуацыя склалася з таматамі, на якіх пастаянна прысутнічала некалькі клонально ліній, прычым іх склад год ад года мяняўся (Fry et al., 2009).
У 2009 г. у ЗША вылілася маштабная эпідэмія фітафтарозу на таматах. Асаблівасцю гэтай пандэміі стала практычна адначасовае яе пачатак у многіх месцах паўночна-ўсходняй частцы ЗША, прычым яна апынулася звязаная з масавымі продажамі заражанай расады таматаў у буйных садовых цэнтрах (Fry et al., 2013 года). Страты ўраджаю аказаліся велізарнымі. Микросателлитный аналіз здзіўленых узораў дазволіў усталяваць, што пандемичный штам належаў да клонально лініі US-22 А2-тыпу спарвання. У 2009 г. доля гэтага генатыпу ў амерыканскай папуляцыі P. infestans дасягнула 80% (Fry et al., 2013 года). У наступныя гады ў папуляцыі няўхільна павялічвалася доля агрэсіўных генатыпаў US-23 (пераважна на таматах) і US-24 (на бульбе), аднак пасля 2011 г. частата выяўлення US-24 істотна знізілася, і на цяперашні час каля 90% папуляцыі патогена ў ЗША прадстаўлена генатыпам US-23 (Fry et al., 2015).
У Канадзе, як і ў ЗША, у канцы 90-х гг. які дамінаваў генатып US-1 быў выцеснены US-8, дамінуючыя пазіцыі якога заставаліся непарушнымі да 2008 г. У 2009-2010 гг. у Канадзе здарыліся сур'ёзныя эпідэміі фітафтарозу, звязаныя з продажамі заражанай расады тамата, але выкліканыя яны былі генатыпам US-23 і US-8 (Kalischuk et al., 2012). Характэрным аказалася дакладнае геаграфічнае размежаванне гэтых генатыпаў: US-23 дамінаваў у заходніх правінцыях Канады (68%), у той час як US-8 панаваў ва ўсходніх правінцыях (83%). У наступныя гады US-23 распаўсюдзіўся ва ўсходнія рэгіёны, аднак у цэлым яго доля ў папуляцыі некалькі знізілася на фоне з'яўлення ў краіне генатыпаў US-22 і US-24 (Peters et al., 2014). Да цяперашняга часу US-23 захоўвае дамінуючыя пазіцыі на тэрыторыі ўсёй Канады; US-8 прысутнічае ў Брытанскай Калумбіі, а US-23 і US-24 - у Антарыё (Peters, 2017).
Такім чынам, паўночнаамерыканскія папуляцыі P. infestans ўяўляюць сабой, па-асноўным, клонально лініі. За апошнія 40 гадоў колькасць выяўленых клонально генатыпаў дасягнула 24. Нягледзячы на тое, што ў папуляцыі прысутнічаюць штамы абодвух тыпаў спарвання, верагоднасць з'яўлення новых генатыпаў ў выніку палавой рэкамбінацыі застаецца досыць нізкай. Тым не менш, у апошнія 20 гадоў было зафіксавана некалькі выпадкаў з'яўлення эфемерных рэкамбінантныя папуляцый (Gavino et al., 2000.; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), прычым у адным выпадку вынікам скрыжавання стаў генатып US-11 , на доўгія гады замацаваны ў Паўночнай Амерыцы (Gavino et al., 2000). Да 2009 г. змены ў структуры папуляцый былі звязаны са з'яўленнем новых, больш агрэсіўных генатыпаў з іх наступнай міграцыяй і выцясненнем раней дамінавалі папярэднікаў. Здарыліся ў 2009-2010 гг. у ЗША і Канадзе эпифитотии ўпершыню паказалі, што ў эпоху глабалізацыі ўспышкі хваробы могуць быць звязаныя і з актыўным распаўсюджваннем новых генатыпаў пры продажах заражанага пасадкавага матэрыялу.
Паўднёвая Амерыка
Аж да апошняга часу даследаванні паўднёваамерыканскіх папуляцый P. infestans не адрозніваліся ні рэгулярнасцю, ні маштабнасцю. Вядома, што структура гэтых папуляцый досыць простая і ўключае 1-5 клонально ліній на краіну (Forbes et al., 1998). Так, да 1998 г. на бульбе былі выяўленыя генатыпы US-1 (Бразілія, Чылі) BR-1 (Бразілія, Балівія, Уругвай, Парагвай), EC-1 (Эквадор, Калумбія, Перу і Венесуэла), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 і AR-5 (Аргенціна), PE-3 і PE-7 (паўднёвая частка Перу). Тып спарвання А2 прысутнічаў у Бразіліі, Балівіі і Аргенціне і ня выяўлялася далей балівійскага-перуанскай мяжы ў раёне возера Тытыкака, за якой у Андах дамінаваў генатып ЕС-1 А1-тыпу. На таматах дамінуючым генатыпам ва ўсёй Паўднёвай Амерыцы заставаўся US-1.
Сітуацыя больш-менш захоўвалася і ў 2000-х гг. Важным момантам стала выяўленне ў Паўночных Андах на дзікарослых сваяках бульбы (S. brevifolium і S. tetrapetalum) новай клонально лініі EC-2 А2-тыпу (Oliva et al., 2010). Філагенетычныя даследаванні паказалі, што гэтая лінія не з'яўляецца цалкам ідэнтычнай P. infestans, хоць і блізкароднаснымі ёй, у сувязі з чым было прапанавана лічыць яе, а таксама яшчэ адну лінію, ЕС-3, выдзеленую з які расце ў Андах таматнага дрэва S. betaceum, новым выглядам, якія атрымалі назву P. andina; аднак статус гэтага віду (самастойны выгляд ці гібрыд P. infestans c нейкі яшчэ невядомай лініяй) пакуль усё ж застаецца смутны (Delgado et al., 2013 года).
У цяперашні час усё амерыканскія папуляцыі P. infestans з'яўляюцца клонально. Нягледзячы на прысутнасць абодвух тыпаў спарвання рэкамбінантныя папуляцый выяўлена не было. На таматах паўсюдна прысутнічае генатып US-1, па-відаць, выцеснены з бульбы лакальнымі штамамі, дакладнае паходжанне якіх пакуль невядома. У Бразіліі, Балівіі і Уругваі прысутнічае генатып BR-1; у Перу, нароўні з US-1 і ЕС-1, існуе некалькі іншых лакальных генатыпаў. У Андах дамінуючую пазіцыю захоўвае клонально лінія EC-1, узаемаадносіны якой з нядаўна выяўленай P. andina пакуль застаюцца нявывучанымі. Адзіным «нестабільным» месцам, дзе за перыяд 2003-2013 гг. адбываліся істотныя змены папуляцыі, стаў Чылі (Acuña et al., 2012), дзе ў 2004-2005 гг. папуляцыя патогена стала характарызавацца устойлівасцю да металаксилу і новым гаплатыпаў мітахандрыяльнай ДНК (Ia замест раней які прысутнічаў Ib). З 2006 па 2011 гг. у папуляцыі дамінаваў генатып 21 (па SSR), доля якога дасягаў 90%, пасля чаго пальма першынства перайшла да генатыпе 20, частата встречаемості якога ў наступныя два гады ўтрымлівалася на ўзроўні каля 67% (Acuña, 2015).
Еўропа
У гісторыі Еўропы было, як мінімум, дзве хвалі міграцыі P. infestans з Паўночнай Амерыкі: у XIX ст. (HERB-1) і пачатку ХХ стагоддзя (US-1). Паўсюднае распаўсюджванне металаксилсодержащих фунгіцыдаў ў 70-х гг. прывяло да выцяснення дамінавалі генатыпу US-1 і замене яго новымі генатыпам. У выніку ў большасці краін Заходняй Еўропы папуляцыі патогены былі прадстаўлены, у асноўным, некалькімі клонально лініямі.
Выкарыстанне микросателлитного аналізу для аналізу папуляцый патогена дазволіла выявіць сур'ёзныя змены, якія адбыліся на тэрыторыі Заходняй Еўропы ў 2005-2008 г. У 2005 г. у Вялікабрытаніі была выяўленая новая клонально лінія, якая атрымала назву 13_А2 (ці "Blue 13") і характарызаваць тыпам спарвання А2 , высокай агрэсіўнасцю і ўстойлівасцю да фениламидам (Shaw et al., 2007). Гэты ж генатып быў знойдзены ў узорах, сабраных ў 2004 г. у Нідэрландах і Паўночнай Францыі, што дало падставы выказаць здагадку яго міграцыю ў Вялікабрытанію з тэрыторыі кантынентальнай Еўропы, магчыма, з насенным бульбай (Cooke et al., 2007). Даследаванне геному прадстаўнікоў гэтай клонально лініі паказала высокую ступень палімарфізму яго паслядоўнасці (да 2016 г. колькасць яго субклональных варыяцый дасягнула 340) і значную ступень варыяцыі ўзроўню экспрэсіі генаў, у тым ліку генаў-эффекторов, у працэсе інфікавання раслін (Cooke et al., 2012 па; Cooke, 2017). Гэтыя асаблівасці, разам з павялічанай працягласцю биотрофной фазы, маглі стаць прычынай падвышанай агрэсіўнасці 13_А2 і яго здольнасці дзівіць нават ўстойлівыя да фітафтарозу гатункі бульбы.
У наступныя некалькі гадоў генатып імкліва распаўсюдзіўся па краінах Паўночна-Заходняй Еўропы (Вялікабрытанія, Ірландыя, Францыя, Бельгія, Нідэрланды, Германія) з адначасовым выцясненнем раней дамінавалі там генатыпаў 1_А1, 2_А1, 8_А1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. 2011; Van den Bosch et al. 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Па дадзеных сайта www.euroblight.net, доля 13_А2 у папуляцыях згаданых краін дасягала 60-80% і вышэй; прысутнасць гэтага генатыпу было таксама зафіксавана ў некаторых краінах Усходняй і Паўднёвай Еўропы. Аднак у 2009-2012 гг. 13_А2 страціў дамінуючыя пазіцыі ў Вялікабрытаніі і Францыі, саступіўшы лініі 6_А1 (у Ірландыі - 8_А1), а ў Нідэрландах і Бельгіі быў часткова замешчаны генатыпам 1_А1, 6_А1 і 33_А2 (Cooke et al., 2012 па; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Да цяперашняга часу каля 70% заходнееўрапейскай папуляцыі P. infestans з'яўляецца моноклональной. Паводле дадзеных сайта www.euroblight.net, дамінуючымі генатыпаў ў краінах Паўночна-заходняй Еўропы (Вялікабрытанія, Францыя,
Нідэрланды, Бельгія) застаюцца, прыкладна ў роўнай суадносінах, 13_А2 і 6_А1, прычым апошні практычна не сустракаецца за межамі названага рэгіёну (за выключэннем Ірландыі), але налічвае ўжо не менш 58 субклонов (Cooke, 2017). Варыяцыі 13_А2 ў прыкметным колькасці прысутнічаюць у Германіі, а таксама спарадычна адзначаюцца ў краінах Цэнтральнай і Паўднёвай Еўропы. Генатып 1_А1 складае істотную частку папуляцый Бельгіі і часткова Нідэрландаў і Францыі. Генатып 8_А1 стабілізаваўся ў еўрапейскай папуляцыі на ўзроўні 3-6%, за выключэннем Ірландыі, дзе ён захоўвае лідзіруючыя пазіцыі і падзяліўся на два субклона (Stellingwerf, 2017). Нарэшце, у 2016 г. адзначана павелічэнне частаты встречаемості новых генатыпаў 36_А2 і 37_А2, упершыню зарэгістраваных у 2013-2014 гг .; да цяперашняга часу гэтыя генатыпы сустракаюцца на тэрыторыі Нідэрландаў і Бельгіі і часткова Францыі і Германіі, а таксама ў паўднёвай частцы Вялікабрытаніі (Сooke, 2017). Прыкладна 20-30% заходнееўрапейскай папуляцыі штогод прадстаўлена унікальнымі генатыпам.
У адрозненне ад Заходняй Еўропы, да моманту з'яўлення генатыпу 13_А2, папуляцыі Паўночнай Еўропы (Швецыя, Нарвегія, Данія, Фінляндыя) былі прадстаўлены не клонально лініямі, а вялікай колькасцю унікальных генатыпаў (Brurberg et al.,
2011). У перыяд актыўнага распаўсюджвання 13_А2 па краінах Заходняй Еўропы прысутнасць гэтага генатыпу ў Скандынавіі не было адзначана аж да 2011 г., калі ён упершыню быў знойдзены ў Паўночнай Ютландыі (Данія), дзе вырошчваюць, у асноўным, прамысловыя гатункі бульбы з актыўным выкарыстаннем металаксил-змяшчаюць фунгіцыдаў (Nielsen et al., 2014). Паводле дадзеных сайта www.euroblight.net, генатып 13_А2 быў таксама знойдзены ў некалькіх узорах з Нарвегіі і Даніі ў 2014 г. і ў некалькіх нарвежскіх узорах ў 2016 г .; акрамя таго, у 2013 г. у Фінляндыі было адзначана прысутнасць у нязначнай колькасці генатыпу 6_А1. Асноўнай прычынай няўдачы 13_А2 і іншых клонально ліній у заваёве Скандынавіі лічацца кліматычныя адрозненні гэтага рэгіёну ад краін Заходняй Еўропы.
Акрамя таго, што прахалоднае лета і халодная зіма спрыяюць выжыванню ня столькі вегетатыўнага міцэліем, колькі ооспор (Sjöholm et al., 2013 года), замярзанне глебы ў зімовы перыяд (чаго звычайна не адбываецца ў больш цёплых краінах Заходняй Еўропы) спрыяе сінхранізацыі прарастання ооспор і пасадкі бульбы, што ўзмацняе іх ролю як крыніцы першаснай інфекцыі (Brurberg et al., 2011). Варта таксама адзначыць, што ва ўмовах поўначы развіццё інфекцыі з ооспор апярэджвае развіццё клубневые інфекцыі, што, у канчатковым выніку, прадухіляе дамінаванне хай нават больш агрэсіўных, але пазней якія развіліся клонально ліній (Yuen, 2012). Структура найбольш даследаваных папуляцый P. infestans ў краінах Усходняй Еўропы (Польшча, Прыбалтыка) вельмі падобная з такой у Скандынавіі.
Тут таксама прысутнічаюць абодва тыпу спарвання і пераважная большасць генатыпаў, вызначаных пры дапамозе SSR аналізу, з'яўляюцца унікальнымі (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Як і ў Паўночнай Еўропе, распаўсюджванне клонально ліній (у першую чаргу генатыпу 13_А2) практычна не закранула лакальныя папуляцыі патогены, якія захоўваюць высокі ўзровень разнастайнасці з адсутнасцю выяўленых дамінантных ліній.
Прысутнасць 13_А2 эпізадычна адзначаецца на палях з камерцыйнымі гатункамі бульбы. У Расіі сітуацыя складваецца аналагічным чынам. Микросателлитный аналіз изолятов P. infestans, сабраных у 2008-2011 гг. у 10 розных рэгіёнах еўрапейскай часткі Расіі, паказаў высокую ступень генатыпічнай разнастайнасці і поўная адсутнасць супадзенняў з еўрапейскімі клонально лініямі (Statsyuk et al., 2014). Праведзенае праз некалькі гадоў даследаванне узораў P. infestans, сабраных у Ленінградскай вобласці ў 2013-2014 гг., Паказала істотныя адрозненні паміж імі і выяўленымі ў папярэднім даследаванні генатыпаў з гэтай галіне. У абодвух даследаваннях заходнееўрапейскіх генатыпаў выяўлена не было (Beketova et al., 2014; Кузняцова і інш., 2016).
Высокае генетычнае разнастайнасць ўсходне-еўрапейскіх папуляцый P. infestans і адсутнасць у іх дамінуючых клонально ліній можа быць звязана з некалькімі прычынамі. Па-першае, як і ў Паўночнай Еўропе, кліматычныя ўмовы разгледжаных краін садзейнічаюць фармаванню ооспор ў якасці першаснай крыніцы інфекцыі (Уланава і інш., 2010; Chmielarz et al., 2014). Па-другое, значная частка бульбы, якая вырабляецца ў дадзеных краінах, вырошчваецца ў дробных прыватных гаспадарках, часцяком акружаных лясамі ці іншымі перашкодамі для свабоднага перамяшчэння інфекцыйнага матэрыялу (Chmielarz et al., 2014). Як правіла, бульба, які гадуецца ў такіх умовах, практычна не апрацоўваецца хімічнымі прэпаратамі, а выбар гатункаў грунтуецца на іх фитофтороустойчивости, г.зн. адсутнічае селектыўнае ціск па агрэсіўнасці і ўстойлівасці да металаксилу, што пазбаўляе ўстойлівыя генатыпы, такія як 13_А2, перавагі перад астатнімі генатыпаў (Chmielarz et al., 2014). Нарэшце, з-за невялікіх памераў зямельных участкаў, іх ўласнікі звычайна не практыкуюць севазварот, гадамі гадуючы бульбу на адным і тым жа месцы, што спрыяе назапашвання генетычна разнастайнага инокулюма (Runno-Paurson et al., 2016; Еланский, 2015; Elansky et al ., 2015).
Азія
Аж да апошняга часу структура папуляцый P. infestans ў Азіі заставалася адносна малавывучанай. Было вядома, што яна прадстаўлена пераважна клонально лініямі, а ўплыў палавой рэкамбінацыі на з'яўленне новых генатыпаў вельмі мала. Так, напрыклад, у 1997-1998 гг. у азіяцкай часткі Расіі (Сібір і Далёкі Ўсход) папуляцыя патогена была прадстаўлена толькі трыма генатыпаў з перавагай генатыпу SIB-1 (Elansky et al., 2001). Прысутнасць клонально ліній патогена было паказана ў такіх краінах як Кітай, Японія, Карэя, Філіпіны і Тайвань (Koh et al., 1994.; Chen et al., 2009). Якая дамінавала на вялікай тэрыторыі Азіі клонально лінія US-1 у канцы 90-х - пачатку 2000-х гг. практычна паўсюдна пачатку выцясняцца іншымі генатыпаў, якія, у сваю чаргу, саступалі месца новым. У большасці выпадкаў змены ў структуры і складзе папуляцый ў азіяцкіх краінах былі звязаны з міграцыяй новых генатыпаў звонку. Так, у Японіі за выключэннем генатыпу JP-3, усе астатнія японскія генатыпы, якія з'явіліся пасля US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), маюць больш-менш даказанае знешняе паходжанне (Akino et al., 2011) . У Кітаі да цяперашняга моманту існуе тры асноўных папуляцыі патогены, якія маюць дакладнае геаграфічнае падзел; ператок генаў паміж гэтымі папуляцыямі адсутнічае або вельмі слабы (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Генатып 13_А2 з'явіўся на тэрыторыі Кітая ў яго паўднёвых правінцыях (Юннань і Сычуань) у 2005-2007 гг., А ў 2012-1014 гг. быў таксама заўважаны на паўночным усходзе краіны (Li et al., 2013b). У Індыі 13_А2 з'явіўся як мяркуецца, у той жа час, што і ў Кітаі, хутчэй за ўсё, з заражаным насенным бульбай (Chowdappa et al., 2015), і ў 2009-2010 гг. выклікаў сур'ёзную эпифитотию фітафтарозу на тамаце на поўдні краіны, пасля чаго распаўсюдзіўся на бульбу і ў 2014 годзе стаў прычынай ўспышкі фітафтарозу ў Заходняй Бенгаліі, якая прывяла да разбурэння і самагубстваў многіх мясцовых фермераў (Fry, 2016).
Афрыка
Аж да 2008-2010 гг. сістэматычныя даследаванні P. infestans ў краінах Афрыкі не праводзіліся. У сапраўдны момант афрыканскія папуляцыі P. infestans могуць быць падзеленыя на дзве групы, прычым гэта падзел выразна асацыяваны з фактам імпарту насеннай бульбы з Еўропы.
У Паўночнай Афрыцы, актыўна якая імпартуе насеннай бульбу з Еўропы, практычна ва ўсіх рэгіёнах шырока прадстаўлены тып спарвання А2, што забяспечвае тэарэтычную магчымасць з'яўлення новых генатыпаў ў выніку палавой рэкамбінацыі (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Акрамя таго, у Алжыры адзначаецца прысутнасць генатыпаў 13_А2, 2_А1 і 23_А1 з выяўленым дамінаваннем першага з іх, а таксама паступовае зніжэнне да поўнага знікнення долі унікальных генатыпаў (Rekad et al., 2017). У адрозненне ад астатняй частцы рэгіёну, у Тунісе (за выключэннем паўночнага ўсходу краіны) папуляцыя патогена прадстаўлена пераважна тыпам спарвання А1 (Harbaoui et al., 2014).
Дамінуючай тут з'яўляецца клонально лінія NA-01. У цэлым доля клонально ліній у папуляцыі складае толькі 43%. У Усходняй і Паўднёвай Афрыцы, дзе аб'ёмы імпарту насеннага матэрыялу знікаюча малыя (Fry et al., 2009), P. infestans прадстаўлена толькі двума клонально лініямі А1-тыпу, US-1 і KE-1, прычым апошняя актыўна выцясняе першую на бульбе ( Pule et al., 2012 па; Njoroge et al., 2016). На гэты час абодва гэтых генатыпу маюць прыкметнае колькасць субклональных варыяцый.
Аўстралія
Першае паведамленне аб праявах фітафтарозу на бульбе ў Аўстраліі датуецца 1907 годзе, а першая эпифитотия, як мяркуецца выкліканая моцнымі дажджамі ў летнія месяцы, здарылася ў 1909-1911 гг. (Drenth et al., 2002). У цэлым, аднак, фітафтароз не мае істотнага эканамічнага значэння для краіны. Спарадычныя ўспышкі фітафтарозу, справакаваныя ўмовамі надвор'я, якія забяспечваюць павышаную вільготнасць, здараюцца не часцей чым раз у 5-7 гадоў і лакалізаваны пераважна ў паўночнай Тасманіі і цэнтральнай частцы правінцыі Вікторыя. У сувязі з вышэйпададзеным, публікацыі, прысвечаныя вывучэнню структуры аўстралійскай папуляцыі P. infestans, практычна адсутнічаюць. Апошняя даступная інфармацыя адносіцца да 1998-2000 гг. (Drenth et al., 2002). Паводле дадзеных аўтараў, папуляцыя штата Вікторыя ўяўляла сабой клонально лінію US-1.3, што ўскосна пацвярджала міграцыю гэтага генатыпу з ЗША. Тасманийские жа ўзоры былі вылучаныя ў тып AU-3, які адрозніваецца ад генатыпаў, якія прысутнічалі на той момант у іншых частках свету.
Асаблівасці развіцця фітафтарозу ў Расіі
У Еўропе ў якасці першаснага инокулюма на бульбе разглядаюць інфекцыю, прыўнесеныя з хворымі насеннымі клубнямі, перазімавалыя ў глебе ооспоры, а таксама зооспорангии, прынесеныя ветрам з раслін, якія выраслі з перазімавалых клубняў на леташніх палях ( «волонтерные» расліны), альбо на кучах адбракаваных пры закладцы на захоўванне клубняў. З іх найбольш небяспечная крыніца інфекцыі лічацца расліны, якія вырасьлі на кучах адбракаваных клубняў, бо там колькасць прарослых клубняў часта значна, і зооспорангии могуць з іх разносіцца на вялікія адлегласці. Астатнія крыніцы (ооспоры, «волонтерные» расліны) не гэтак небяспечныя, бо расліны не прынята вырошчваць на адных і тых жа палях часцей, чым адзін раз у 3-4 гады. Інфекцыя ад хворых насенных клубняў таксама мінімальная ў сувязі з добрай сістэмай кантролю якасці насеннага матэрыялу.
У цэлым, колькасць инокулюма ў еўрапейскіх папуляцыях абмежавана, у сувязі з чым нарастанне эпідэміі адбываецца досыць павольна і паддаецца паспяховаму кантролі з дапамогай хімічных фунгіцыдных прэпаратаў. Асноўнай задачай у еўрапейскіх умовах становіцца барацьба з інфекцыяй ў той фазе, калі пачынаецца масавы разлёт зооспорангиев з здзіўленых раслін.
У Расіі сітуацыя кардынальна іншая. Большая частка ўраджаю бульбы і тамата вырошчваецца на невялікіх прыватных агародах; ахоўныя мерапрыемствы на іх альбо наогул не праводзяцца, альбо фунгіцыдныя апрацоўкі праводзяцца ў недастатковай ліку і пачынаюцца ўжо пасля з'яўлення фітафтарозу на бацвінні. У выніку прыватныя агароды выступаюць як асноўная крыніца інфекцыі, з іх зооспорангии ветрам пераносяцца на камерцыйныя пасадкі. Гэта пацвярджаецца нашымі прамымі назіраннямі ў Маскоўскай, Бранскай, Кастрамской, Разанскай абласцях: паражэнне раслін на прыватных агародах назіраецца яшчэ да пачатку апрацовак фунгіцыдамі камерцыйных пасадак. Пасля эпідэмія на буйных палях стрымліваецца ужываннем фунгіцыдных прэпаратаў, у той час як на прыватных агародах назіраецца бурнае развіццё фітафтарозу.
У выпадку няправільных або «бюджэтных» апрацовак камерцыйных пасадак агмені фітафтарозу з'яўляюцца і на палях; у далейшым яны актыўна развіваюцца, захопліваючы ўсё вялікія плошчы (Еланский, 2015). Інфекцыя, якая развіваецца на прыватных агародах, аказвае істотны ўплыў на эпідэміі на камерцыйных палях. Ва ўсіх бульбаводчых рэгіёнах Расіі плошча, занятая бульбай на прыватных агародах, у разы пераўзыходзіць сумарную плошчу палёў буйных вытворцаў. У такіх умовах прыватныя агароды можна разглядаць як глабальны рэсурс инокулюма для камерцыйных палёў. Паспрабуем выявіць тыя ўласцівасці, якія характэрныя для генатыпаў штамаў на прыватных агародах.
Пасадка якое не прайшло насеннай і каранцінны кантроль харчовай бульбы, насення тамата, атрыманых ад сумніўных замежных вытворцаў, шматгадовая вырошчванне бульбы і тамата на адных і тых жа плошчах, няправільныя апрацоўкі фунгіцыдамі або іх поўная адсутнасць прыводзяць да цяжкіх эпифитотиям ў прыватным сектары, вынікам якіх з'яўляецца вольны скрыжаванне, гібрыдызацыя і адукацыя ооспор на прыватных агародах. У выніку назіраецца вельмі высокае Генатыпічная разнастайнасць патгена, калі практычна кожны штам унікальны па свайму генатыпе (Elansky et al., 2001, 2015). Пасадка насеннай бульбы рознага генетычнага паходжання робіць малаверагодным з'яўленне клонально ліній, спецыялізаваных да паразы якога-небудзь гатунку. Штамы, селектуе у падобным выпадку, адрозніваюцца універсальнасцю ў адносінах да дзівяцца гатункі, большасць з іх маюць блізкае да максімальнага лік генаў вірулентнасці. Гэта моцна адрозніваецца ад сістэмы «клонально ліній», тыповых для буйных палёў сельгасарганізацый з правільна пастаўленай сістэмай абароны ад фітафтарозу. «Клонально лініі» (калі ўсе штамы ўзбуджальніка фітафтарозу на полі прадстаўлены адным ці некалькімі генатыпаў) паўсюдна распаўсюджаны ў краінах, дзе бульбаводства вядзецца выключна буйнымі гаспадаркамі: Злучаныя Штаты Амерыкі, Нідэрланды, Данія і інш. У Англіі, Ірландыі, Польшчы, дзе таксама традыцыйна распаўсюджана прысядзібная бульбаводства, таксама адзначаецца больш высокае Генатыпічная разнастайнасць на прыватных агародах. «Клонально лініі» ў канцы 20 стагоддзя былі шырока распаўсюджаныя ў Азіяцкай і Далёкаўсходняй частках Расіі (Elansky et al., 2001), што, па-відаць, звязана з выкарыстаннем для пасадкі выключна бульбы ўласнай вытворчасці адных і тых жа гатункаў. Апошні час сітуацыя ў гэтых рэгіёнах таксама пачала мяняцца ў бок павышэння генатыпічнай разнастайнасці папуляцый.
Адсутнасць інтэнсіўных апрацовак фунгіцыднымі прэпаратамі мае і іншае, прамое следства - на гародах не адбываецца назапашвання ўстойлівых штамаў. Сапраўды, нашы вынікі паказваюць, што на прыватных агародах значна радзей, чым на камерцыйных пасадках, выяўляюцца ўстойлівыя да металаксилу штамы.
Тыповая для прыватных агародаў блізкае суседства пасадак бульбы і тамата палягчае міграцыю штамаў паміж гэтымі культурамі, у выніку чаго ў апошняе дзесяцігоддзе сярод штамаў, што выдзяляюцца з бульбы, павысілася доля штамаў, апорных ген устойлівасці да гатункаў вишневидного тамата (Т1), раней характэрны толькі для « таматных »штамаў. Штамы з генам Т1 у большасці выпадкаў аказваюцца высокоагрессивными ў адносінах як да бульбы, так і да таматы.
У апошнія гады фітафтароз на тамаце стаў выяўляцца ў многіх выпадках раней, чым на бульбе. Крыніцай заражэння расады тамата могуць быць ооспоры, якія знаходзяцца ў глебе, альбо ооспоры, прысутныя ў насенні тамата, або прыліплыя да іх (Rubin et al., 2001). У апошнія 15 гадоў у крамах з'явілася вялікая колькасць недарагіх фасаваных насення, пераважна імпартнай вытворчасці, на выкарыстанне якіх і перайшла большая частка дробных вытворцаў. З насеннем могуць прыходзіць штамы з генатыпам, тыповымі для рэгіёнаў іх вырошчвання. У далейшым гэтыя генатыпы ўключаюцца ў палавой працэс на прыватных агародах, што вядзе да з'яўлення цалкам новых генатыпаў.
Такім чынам, можна канстатаваць, што прыватныя агароды з'яўляюцца глабальным «плавільным катлом", у якім у выніку абмену генетычным матэрыялам перапрацоўваюцца існуючыя генатыпы і з'яўляюцца абсалютна новыя. Пры гэтым іх селекцыя праходзіць ва ўмовах, моцна адрозніваюцца ад ствараюцца для бульбы ў буйных гаспадарках: адсутнасць фунгіцыдных прэса, гатункавы выравненные пасадак, перавага раслін, пашкоджаныя рознымі формамі віруснай і бактэрыяльнай інфекцыі, суседства з таматамі і дзікімі пасленовых, актыўны скрыжаванне і ооспорообразование, магчымасць для ооспор выступаць крыніцай інфекцыі на наступны год.
Усё гэта прыводзіць да вельмі высокага генатыпічнай разнастайнасці прысядзібных папуляцый. Ва ўмовах эпифитотии на гародах адбываецца вельмі хуткае распаўсюджванне фітафтарозу і выкід вялізных колькасцяў спрэчка, пералятаюць на бліжэйшыя камерцыйныя пасадкі. Аднак, патрапіўшы на камерцыйныя поля з правільнай сістэмай агратэхнікі і хімабароны, якія прыляцелі спрэчкі практычна не маюць магчымасці ініцыяваць эпифитотию на поле, што звязана з адсутнасцю ўстойлівых да фунгіцыдаў і спецыялізаваных да вырошчваюць гатункі клонально ліній.
Іншым крыніцай першаснага инокулюма могуць быць здзіўленыя клубні, якія трапілі ў камерцыйныя пасадкі з насенным матэрыялам. Гэтыя клубні былі вырашчаны, як правіла, на палях з добрай агратэхнікай і інтэнсіўнай хімабароны. Генатыпы изолятов, якія ўразілі клубні, адаптаваныя да развіцця на сваім гатунку. Гэтыя штамы значна больш небяспечны, чым для камерцыйных пасадак чым инокулюм, які адбываецца з прыватных агародаў. У карысць гэтай здагадкі кажуць і вынікі нашых даследаванняў. Папуляцыі, выдзеленыя з буйных палёў з правільна якая праводзіцца хімабароны і добрай агратэхнікай не адрозніваюцца высокім Генатыпічная разнастайнасцю. Часта гэта некалькі клонально ліній, якія адрозніваюцца высокай агрэсіўнасцю.
Штамы з камерцыйнага насеннага матэрыялу могуць трапіць у папуляцыі на гародах і ўключыцца ў працэсы, якія ідуць у іх. Аднак ва ўмовах агарода іх канкурэнтаздольнасць будзе значна ніжэй, чым на камерцыйным поле, і неўзабаве яны перастануць існаваць у выглядзе клонально лініі, але іх гены могуць быць выкарыстаны ў «агароднай» папуляцыі.
Інфекцыя, якая развіваецца на «волонтерных» расліны і на кучах адбракаваных пры ўборцы клубняў для Расеі не гэтак актуальная, бо ў асноўных бульбаводчых рэгіёнах Расіі назіраецца глыбокі зімовы прамярзанне глебы, і расліны з перазімавалых ў глебе клубняў развіваюцца рэдка. Больш за тое, як паказваюць нашы эксперыменты, узбуджальнік фітафтарозу ня выжывае пры адмоўных тэмпературах нават на якія захавалі жыццяздольнасць клубнях. У аридной зоне, дзе практыкуецца вырошчванне ранняй бульбы, фітафтароз сустракаецца досыць рэдка з-за сухога і гарачага сезона вегетацыі.
Такім чынам, у цяперашні час мы назіраем падзел папуляцый P. infestans на «палявыя» і «агародныя». Аднак апошнія гады назіраюцца працэсы, якія вядуць да збліжэння і узаемапранікненню генатыпаў з гэтых папуляцый.
Сярод іх можна адзначыць агульнае павышэнне пісьменнасці дробных вытворцаў, з'яўленне даступных дробных фасовок насеннай бульбы, распаўсюджванне фунгіцыдных прэпаратаў у дробнай фасоўцы, страта насельніцтвам страху перад "хіміяй".
Ўзнікаюць сітуацыі, калі дзякуючы актыўнай дзейнасці аднаго пастаўшчыка цэлыя пасёлкі аказваюцца засаджанага насеннымі клубнямі аднаго гатунку і забяспечаны дробнымі фасоўкі адных і тых жа пестыцыдаў. Цалкам можна выказаць здагадку, што бульба таго ж гатунку апынецца і на камерцыйных пасадках паблізу.
З іншага боку, некаторыя гандлююць пестыцыдамі кампаніі прасоўваюць «бюджэтныя» схемы химобработок. У гэтым выпадку колькасць рэкамендаваных апрацовак заніжаецца і прапануюцца самыя танныя фунгіцыды, прычым ўпор робіцца не на недапушчэнне развіцця фітафтарозу аж да Скошванне бацвіння, а на некаторую затрымку эпифитотии з мэтай павелічэння выхаду ўраджаю. Такія схемы эканамічна абгрунтаваныя пры вырошчванні харчовай бульбы з нізкагатунковага насеннага матэрыялу, калі пра атрыманне высокага ўраджаю гаворка ў прынцыпе не ідзе. Аднак у гэтым выпадку, у адрозненне ад агародных папуляцый, выраўнаваны генетычны фон бульбы спрыяе адбору спецыфічных фізіялагічных рас, вельмі небяспечным для дадзенага гатунку.
У цэлым, тэндэнцыі да збліжэння «агароднага» і «палявой» спосабаў вытворчасці бульбы ўяўляюцца нам даволі небяспечнымі. Для прадухілення іх негатыўных наступстваў як у прысядзібным, так і ў камерцыйным сектары спатрэбіцца як кантроль сартыментаў насеннай бульбы і асартыменту фунгіцыдаў, прапанаваных прыватнікам ў дробнай фасоўцы, так і адсочванне схем абароны бульбы і прымянення фунгіцыдных прэпаратаў у камерцыйным сектары.
На участках прыватнага сектара назіраецца інтэнсіўнае развіццё не толькі фітафтарозу, але і альтернариоза. Большасць уладальнікаў ЛПХ спецыяльных мер для абароны ад альтернариоза не робяць, прымаючы развіццё альтернариоза за натуральнае завяданне бацвіння або развіццё фітафтарозу. Таму пры масавым развіцці альтернариоза на адчувальных гатунках прысядзібныя ўчасткі могуць служыць крыніцай инокулюма і для камерцыйных пасадак.
механізмы зменлівасці
мутацыйных працэс
Паколькі ўзнікненне мутацый - выпадковы працэс, які праходзіць з нізкай частатой, ўзнікненне мутацый па якім-небудзь локусу залежыць ад частаты мутирования гэтага локуса і колькасці папуляцыі. Пры вывучэнні частоты мутацый штамаў P. infestans звычайна вызначаюць колькасць калоній, якія выраслі на селектыўных пажыўных асяроддзях пасля апрацоўкі хімічнымі або фізічнымі мутагенамі. Як відаць з прадстаўленых у табліцы 8 дадзеных, частата мутирования аднаго і таго ж штаму па розных локусам можа адрознівацца на некалькі парадкаў. Высокая частата мутацый ўстойлівасці да металаксилу можа быць адной з прычын назапашвання рэзісцентный да яго штамаў ў прыродзе.
Частата спантанных або індукаваных мутацый, вылічэнні на падставе лабараторных доследаў, не заўсёды адпавядае працэсаў, што адбываюцца ў прыродных папуляцыях, па наступных прычынах:
1. Пры несинхронных ядзерных дзяленнях немагчыма ацаніць частату мутацый, якія прыходзяцца на адну ядзерную генерацыю. Таму большасць эксперыментаў дае інфармацыю толькі непасрэдна аб частаце мутацый, не робячы адрозненняў паміж двума мутацыйных падзеямі і адным падзеяй, наступным за Мітоз.
2. Одношаговые мутацыі звычайна зніжаюць збалансаванасць геному, таму разам з набыццём новага ўласцівасці зніжаецца агульная прыстасаванасць арганізма. Большасць эксперыментальна атрыманых мутацый мае паніжаную агрэсіўнасць і ня фіксуецца ў прыродных папуляцыях. Так, каэфіцыент карэляцыі паміж ступенню ўстойлівасці мутантаў P. infestans да фениламидным фунгіцыдамі і хуткасцю росту на штучнай асяроддзі склаў у сярэднім (-0,62), а устойлівасцю да фунгіцыдаў і агрэсіўнасцю на лісці бульбы (-0,65) (Деревягина і інш. , 1993), што сведчыць аб нізкай прыстасаванасці мутантаў. Мутацыі ўстойлівасці да диметоморфу таксама суправаджаліся рэзкім зніжэннем жыццяздольнасці (Bagirova et al., 2001).
3. Большасць спантанных і індукаваных мутацый рецессивны і не праяўляюцца фенатыпічнае ў эксперыментах, але складаюць нябачны рэзерв зменлівасці прыродных папуляцый. Мутантавыя штамы, вылучаныя ў лабараторных досведах, нясуць дамінантныя або полудоминантные мутацыі (Куліш, Дзякаў, 1979). Мабыць, дыплоідным ядраў тлумачацца няўдалыя спробы атрымаць пад уздзеяннем УФ-апраменьвання мутанты, вірулентные на раней ўстойлівых гатунках (McKee, 1969). Па разліках аўтара, такія мутацыі могуць узнікаць з частатой менш за 1: 500000. Пераход рецессивных мутацый у гомозиготное, фенатыпічнае выяўленае стан можа адбыцца з прычыны палавой або Бясполае рэкамбінацыі (гл. Ніжэй). Аднак нават у такім выпадку мутацыя можа маскіравацца дамінантнай алеляў ядраў дзікага тыпу ў ценотическом (шмат'ядравых) міцэліем і фенатыпічнае фіксавацца толькі пры адукацыі одноядерных зооспоры.
Табліца 8. Частата мутацый P. infestans да ростингибирующим рэчывам пад дзеяннем нитрозометилмочевины (пазыковая, Дзякаў 1986; Bagirova et al., 2001)
злучэнне | частата мутацый |
оксітэтрацыклін | 6,9 х 10-8 |
Бластыцыдзін S | 7,2 х 10-8 |
Cтрэптаміцын | 8,3х10-8 |
Трыхатэцын | 1,8 х 10-8 |
Цыклаэксімід | 2,1 х 10-8 |
Даканіў | <4 x 10-8 |
Дыметаморф | 6,3 х 10-7 |
Металаксіл | 6,9 х 10-6 |
Памеры папуляцый таксама гуляюць вырашальную ролю ў з'яўленні спантанных мутацый. У вельмі вялікіх папуляцыях, у якiх колькасць клетак N> 1 / a, дзе а - хуткасць мутирования, мутацыя перастае быць выпадковым з'явай (Квітко, 1974).
Разлікі паказваюць, што пры сярэдняй заражанасці бульбянога поля (35 плям на адным расліне) на адным гектары штодня фармуецца 8х1012 спрэчка (Дзякаў, Супрун, 1984). Па-відаць, у такіх папуляцыях сустракаюцца ўсе дазволеныя тыпам абмену мутацыі па кожным локусу. Нават рэдкая мутацыя, якая ўзнікае з частатой 10-9, будзе здабыты тысячью асобін з мільёнаў, якія жывуць на адным гектары бульбянога поля. Для мутацый, якія ўзнікаюць з больш высокай частатой (напрыклад, 10-6), у такой папуляцыі могуць штодня узнікаць разнастайныя парныя мутацыі (адначасова па двух локусам), г.зн. мутацыйных працэс заменіць рэкамбінацыі.
міграцыі
Для P. infestans вядомыя два галоўных тыпу міграцыі: на блізкія адлегласці (у межах бульбянога поля або суседніх палёў) шляхам разносу зооспорангиев паветранымі токамі або дажджавымі пырскамі, і на далёкія адлегласці - з пасадкавымі клубнямі або перавозяцца пладамі тамата. Першы спосаб забяспечвае пашырэнне ачага хваробы, другі - стварэнне новых ачагоў ў месцах, аддаленых ад першаснага.
Распаўсюджванне інфекцыі з клубнямі і пладамі тамата не толькі спрыяе ўзнікненню хваробы ў новых месцах, але і з'яўляецца асноўнай крыніцай генетычнай разнастайнасці папуляцый. У Маскоўскай вобласці вырошчваецца бульба, прывезены з розных рэгіёнаў Расіі і Заходняй Еўропы. Плён тамата прывозяцца з паўднёвых рэгіёнаў Расіі (Астраханская вобл., Краснадарскі край, Паўночны Каўказ). Насенне тамата, якія таксама могуць служыць крыніцамі інфекцыі (Rubin et al., 2001), таксама прывозяцца з паўднёвых рэгіёнаў Расіі, Кітая, дзяржаў Еўропы і іншых краін.
Па разліках Э. Майра (1974) генетычныя змены ў лакальнай папуляцыі, абумоўленыя мутацыямі, рэдка перавышаюць 10-5 на локуса, у той час як у адкрытых папуляцыях абмен з прычыны сустрэчнага струменя генаў складае не менш 10-3 - 10-4.
Міграцыяй у заражаных клубнях абумоўлена трапленне P. infestans ў Еўропу, распаўсюджванне па ўсіх рэгіёнах свету, дзе вырошчваюць бульбу; імі выкліканыя самыя сур'ёзныя папуляцыйныя перабудовы. Фітафтароз на бульбе з'явіўся на тэрыторыі Расійскай імперыі амаль адначасова з яго з'яўленнем у Заходняй Еўропе.
Паколькі хвароба ўпершыню была адзначана ў 1846-1847 гг ў Прыбалтыцы і толькі ў наступныя гады распаўсюдзілася на Беларусі і Паўночна-Заходніх раёнах Расіі, яе заходнееўрапейскае паходжанне відавочна. Не гэтак відавочны першая крыніца фітафтарозу у Старым Свеце. Якая развіваецца Фраем з суаўтарамі (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin 1995, Goodwin et al., 1994) гіпотэза мяркуе, што паразіт трапіў з Мексікі спачатку ў Паўночную Амерыку, дзе распаўсюдзіўся па пасевах, а затым быў перавезены ў Заходнюю Еўропу (мал. 7).
У выніку паўторнага дрэйфу (падвойнага эфекту «бутэлькавага горлышка») у Еўропу патрапілі адзінкавыя клоны, нашчадства якіх выклікала пандэмію на ўсёй тэрыторыі Старога Свету, дзе вырошчваюць бульбу. У якасці доказаў гэтай гіпотэзы аўтары прыводзяць, па-першае, паўсюдную встречаемості толькі аднаго тыпу спарвання (А1) і, па-другое, аднастайнасць генатыпаў даследаваных штамаў з розных рэгіёнаў (усе яны па малекулярнай маркерам, якія ўключаюць 2 изоферментных локуса, патэрны фингерпринтинга ДНК і структуру мітахандрыяльнай ДНК, ідэнтычныя, і адпавядаюць апісанаму ў ЗША клону US-1). Аднак некаторыя дадзеныя прымушаюць сумнявацца прынамсі ў некаторых палажэннях выкладзенай гіпотэзы. Аналіз мітахандрыяльнай ДНК P. infestans, выдзеленай з гербарных узораў бульбы, заражаных ў гады першай эпифитотии 40-х гадоў XIX ст, паказаў, што па структуры мітахандрыяльнай ДНК яны адрозніваюцца ад клона US-1, які, такім чынам, быў, па меншай меры, не адзіным крыніц інфекцыі ў Еўропе (Ristaino et al, 2001).
Сітуацыя з фітафтароз зноў пагоршылася ў 80-я гады XX стагоддзя. Адбыліся наступныя змены:
1) Павялічылася сярэдняя агрэсіўнасць папуляцыі, што прывяло, у прыватнасці, да шырокага распаўсюду найбольш шкоднаснай формы фітафтарозу - паразы хвосцікаў і сцеблаў.
2) Адбыўся зрух часу з'яўлення фітафтарозу на бульбе - з канца ліпеня на пачатак ліпеня і нават на канец чэрвеня.
3) Стаў паўсюдна сустракацца тып спарвання А2, які адсутнічае раней у Старым Свеце.
Зменам папярэднічалі дзве падзеі: масавае прымяненне новага фунгіцыду металаксила (Schwinn, Staub, 1980) і выхад Мексікі ў сусветныя экспарцёры бульбы (Niederhauser, 1993). У адпаведнасці з гэтым былі вылучаны дзве прычыны папуляцыйных змен - канверсія тыпу спарвання пад уплывам металаксила (Ko, 1994) і масавы намець новых штамаў з заражанымі клубнямі з Мексікі (Fry, Goodwin 1995). Хоць взаимопревращения тыпаў спарвання пад уплывам металаксила былі атрыманы не толькі Да, але і ў працах, выкананых у лабараторыі МДУ (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), другая гіпотэза пераважней. Разам з з'яўленнем другога тыпу спарвання адбыліся сур'ёзныя змены ў генатып расійскіх штамаў P. infestans, у тым ліку ў нейтральных генах (изоферментных і RFLP-локусах), а таксама ў структуры мітахандрыяльнай ДНК. Комплекс гэтых змен нельга растлумачыць дзеяннем металаксила, хутчэй за адбыўся масавы завоз новых штамаў з Мексікі, якія, быўшы больш агрэсіўнымі (Kato et al., 1997), выціснулі старыя штамы (US-1), стаўшы дамінуючымі ў папуляцыях. Змена складу еўрапейскіх папуляцый адбылося ў вельмі кароткі тэрмін - з 1980 па 1985 гг (Fry et al., 1992). На тэрыторыі былога СССР «новыя штамы» былі выяўленыя ў зборах з Эстоніі 1985 г, гэта значыць раней, чым у Польшчы і Германіі (Goodwin et al., 1994). Апошні раз «стары штам US-1» у Расеі быў выдзелены з здзіўленага тамата ў Маскоўскай вобласці ў 1993 г. (пазыковая і інш., 1997). Таксама і ў Францыі "старыя" штамы сустракаліся ў пасадкі таматаў да пачатку 90-х гадоў, гэта значыць пасля таго, як на бульбе яны даўно зніклі (Leberton, Andrivon, 1998). Змены штамаў P. infestans закранулі многія прыкметы, у тым ліку якія маюць важнае практычнае значэнне, і ўзмацнілі шкоднаснасць фітафтарозу.
палавая рэкамбінацыі
Для таго, каб палавая рэкамбінацыі магла б ўносіць ўклад у зменлівасць, неабходна, па-першае, прысутнасць у папуляцыі двух тыпаў спарвання ў суадносінах, блізкім да 1: 1, і, па-другое, наяўнасць зыходнай варыябельнасці папуляцыі.
Суадносіны тыпаў спарвання моцна вар'іруе ў розных папуляцыях і нават у розныя гады ў адной папуляцыі (табл. 9,10). Прычыны гэтак рэзкіх змяненняў частот тыпаў спарвання ў папуляцыях (як, напрыклад, у Расіі ці ў Ізраілі ў пачатку 90-х гг мінулага стагоддзя) невядомыя, але мяркуюць, што гэта звязана з завозам больш канкурэнтаздольных клонаў (Cohen, 2002).
Некаторыя ўскосныя дадзеныя сведчаць аб праходжанні палавога працэсу ў асобныя гады і ў асобных рэгіёнах:
1) Даследаванні папуляцый з Маскоўскай вобласці паказала, што ў 13 папуляцыях, у якіх доля тыпу спарвання А2 была менш за 10%, агульнае генетычнае разнастайнасць, вылічанае па трох изоферментным локусам, склала 0,08, а ў 14 папуляцыях, у якіх доля А2 перавышала 30%, генетычнае разнастайнасць было ўдвая вышэй (0,15) (Еланский і інш., 1999). Такім чынам, чым вышэй верагоднасць палавога працэсу, тым больш генетычнае разнастайнасць папуляцыі.
2) Сувязь паміж суадносінамі тыпаў спарвання ў папуляцыях і інтэнсіўнасцю адукацыі ооспор назіралі ў Ізраілі (Cohen et al., 1997) і ў Галандыі
(Flier et al., 2004). Нашы даследаванні паказалі, што ў папуляцыях, у якіх изоляты з тыпам спарвання А2 складалі 62, 17, 9 і 6%, ооспоры выяўленыя ў 78, 50, 30 і 15% прааналізаваных лісточкаў бульбы (якія маюць 2 і больш плям) адпаведна.
Узоры з 2 і больш плямамі значна часцей ўтрымлівалі ооспоры, чым ўзоры з 1 плямай (32 і 14% узораў адпаведна) (Апрышко і інш., 2004).
Ооспоры значна часцей сустракаліся ў лісці сярэдняга і ніжняга яруса расліны бульбы (Мыца і інш., 2015; Elansky et al., 2016).
3) У некаторых рэгіёнах былі выяўлены ўнікальныя генатыпы, узнікненне якіх звязваюць з палавой рэкамбінацыяй. Так, у Польшчы ў 1989 г. і ў Францыі ў 1990 г. былі выяўленыя штамы, гомозиготные па локусу глюкоза-6-
фосфатизомеразы (GPI 90/90). Паколькі раней на працягу 10 гадоў сустракаліся толькі гетерозиготы 90/100, гомозиготность прыпісваюць палавой рэкамбінацыі (Sujkowski et al., 1994). У Калумбіі (ЗША) звычайныя изоляты, якія спалучаюць А2 з GPI 100/110 і А1 з GPI 100/100, аднак у канцы сезона 1994 г. (16 жніўня і 9 верасня) былі выяўленыя штамы, якія маюць рэкамбінантныя генатыпы (А1 GPI 100/110 і A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) У некаторых папуляцыях з Польшчы (Sujkowski et al., 1994) і Cеверной Каўказа (Аматханова і інш. 2004) размеркаванне фингерпринтных локусов ДНК і аллозимных локусов бялкоў адпавядае размеркаванні Хардзі-Вайнберга, што сведчыць
аб высокай долі ўкладу палавой рэкамбінацыі ў зменлівасць папуляцый. У іншых рэгіёнах Расіі адпаведнасці размеркаванні Хардзі-Вайнберга ў папуляцыях не выяўлена, але паказана наяўнасць нераўнаважных счаплення, які сведчыць пра перавагу клонального размнажэння (Еланский і інш., 1999).
5) Генетычнае разнастайнасць (GST) паміж штамамі, якія маюць розныя тыпы спарвання (А1 і А2), было больш нізкіх, чым паміж рознымі папуляцыямі (Sujkowski et al., 1994), што ўскосна сведчыць аб палавых скрыжаваннях.
У той жа час ўклад палавой рэкамбінацыі ў папуляцыйнай разнастайнасць не можа быць вельмі высокім. Падлік гэтага ўкладу быў зроблены для папуляцый Маскоўскай вобласці (Еланский і інш., 1999). Па разліках Левонтина (1979) «рэкамбінацыі, якая можа прадукаваць новыя варыянты з двух локусов з частатой, якая не перавышае твор іх гетерозиготностей, становіцца эфектыўнай толькі ў тым выпадку, калі велічыні гетерозиготности па абодвух Алеляў ўжо высокія».
Пры звычайным для Маскоўскай вобласці суадносінах двух тыпаў спарвання, роўным 4: 1, частата рэкамбінацыі складзе 0,25. Верагоднасць таго, што спароўваныя штамы будуць гетерозиготны па двух з трох вывучаных изоферментных локусов, у даследаваных папуляцыях склала 0,01 (2 штаму з 177). Такім чынам, верагоднасць узнікнення падвойных гетерозигот ў выніку рэкамбінацыі не павінна перавышаць іх твор, памножанае на верагоднасць скрыжавання (0,25х0,02х0,02) = 10-4, г.зн. палавыя рекомбинанты звычайна не трапляюць у даследаваную выбарку штамаў. Гэтыя разлікі зробленыя для папуляцый з Маскоўскай вобласці, якія характарызуюцца адносна высокай варыябельнасцю. У мономорфных папуляцыях, падобных сібірскім, палавы працэс, калі нават і адбываецца ў асобных папуляцыях, не можа аказаць ўплыў на іх генетычнае разнастайнасць.
Акрамя таго, для P. infestans характэрныя частыя парушэнні разыходжанні храмасом у мейозе, што прыводзіць да анеуплоідаў (Carter et al., 1999). Такія парушэнні зніжаюць фертыльнасць гібрыдаў.
Парасексуальная рэкамбінацыі, митотическая канверсія генаў
У эксперыментах па зрошчвання штамаў P. infestans, якія маюць мутацыі резистентости да розных інгібітарамі росту, было выяўлена возникновениеmизолятов, ўстойлівых да абодвух інгібітарамі (Shattock, Shaw, 1975; Дзякаў, Кузовникова, 1974; Куліш, Дзякаў,
1979). Ўстойлівыя да двух інгібітарамі росту штамы ўзнікалі з прычыны гетерокариотизации міцэліем, і ў гэтым выпадку расшчапляюцца пры размнажэнні аднаядзернымі зооспоры (Judelson, Ge Yang, 1998), ці не расшчапляецца ў монозооспоровом нашчадства, бо мелі тетраплоидные (паколькі зыходныя изоляты дыплоідным) ядра (Куліш, Дзякаў , 1979). Гетерозиготные диплоиды сегрэгіраваных з вельмі нізкай частатой прычыны гаплоидизации, нерасхождения храмасом і митотического кро- сінговера (Паядынак і інш., 1982). Частату гэтых працэсаў можна было павялічыць з дапамогай пэўных уздзеянняў на гетерозиготные диплоиды (напрыклад, УФ-апрамяненнем прарастаюць спрэчка).
Хоць фарміраванне вегетатыўных гібрыдаў з двайны устойлівасцю адбываецца не толькі in vitro, але і ў заражаных сумессю мутантаў бульбяных клубнях (Куліш і інш., 1978), ацаніць ролю парасексуальной рэкамбінацыі ў генераванні новых генатыпаў ў папуляцыях досыць складана. Частата адукацыі сегрегантов з прычыны гаплоидизации, нерасхождения храмасом і митотического кро- сінговера без спецыяльных уздзеянняў нікчэмная (менш за 10-3).
У аснове ўзнікнення гомозиготных сегрегантов гетерозиготных штамаў можа ляжаць як митотический кро- сінговера, так і митотическая генная канверсія, якая ў P. sojae працякае з частатой ад 3 х 10-2 да 5 х 10-5 на локуса ў залежнасці ад штаму (Chamnanpunt et al. , 2001).
Хоць частата ўзнікнення гетерокарионов і гетерозиготных диплоидов апынулася нечакана высокай (дасягае дзясяткаў адсоткаў), гэты працэс адбываецца толькі пры зрошчванні мутантных культур, атрыманых з аднаго штаму. Пры выкарыстанні розных ізаляваных з прыроды штамаў гетерокариотизация не адбываецца (ці адбываецца з вельмі нізкай частатой) з прычыны наяўнасці вегетатыўнай несумяшчальнасці (Паядынак, Дзякаў, 1981; Анікін і інш., 1997б; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Такім чынам, роля парасексуальной рэкамбінацыі можа быць зведзена толькі да внутриклональной рэкамбінацыі ў гетерозиготных ядрах і пераходу асобных генаў у гомозиготное стан без палавога працэсу. Гэты працэс можа мець эпідэміялагічнае значэнне ў штамаў, якія маюць рецессивную або полудоминантную мутацыю ўстойлівасці да фунгіцыдамі. Пераход яе ў гомозиготное стан з прычыны парасексуального працэсу павысіць рэзістэнтнасць носьбіта мутацыі (пазыковая, Дзякаў, 1986).
Интрогрессия генаў
Гетероталличные віды Phytophthora здольныя крыжаваць з адукацыяй гібрыдных ооспор (гл. Вараб'ёва, Грыднеў, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Прыродны гібрыд двух відаў Phytophthora апынуўся настолькі агрэсіўным, што знішчыў тысячы асобнікаў алешыны ў Вялікабрытаніі (Brasier et al., 1999). P. infestans можа сустракацца з іншымі відамі роду (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum і інш.) На агульных раслінах-гаспадарах і ў глебе, але аб магчымасці ўзнікнення міжыідавых гібрыдаў ў літаратуры мала звестак. У лабараторных умовах былі атрыманы гібрыды паміж P. infestans і P. Mirabilis (Goodwin, Fry, 1994).
Табліца 9. Доля штамаў P. infestans з А2 тыпам спарвання ў розных краінах свету ў перыяд з 1990 па 2000 гады (па дадзеных адкрытых літаратурных крыніц і сайтаў www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Краіна | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Беларусь | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Бельгія | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Эквадор | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Эстонія | 8 (12) | ||||||||||
Англія | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Фінляндыя | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Францыя | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Венгрыя | 72 (32) | ||||||||||
Ірландыя | 4 (145) | ||||||||||
Сяўбу. Ірландыя | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Нідэрланды | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Нарвегія | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Перу | 0 (34 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Польшча | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шатландыя | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швецыя | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
уэльс | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Карэя | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Кітай | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Калумбія | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Уругвай | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Марока | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербія | 76 (37) | ||||||||||
Мексіка (Талука) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Табліца 10. Доля штамаў P. infestans з А2 тыпам спарвання ў розных краінах свету ў перыяд з 2000 па 2011 гады
Краіна | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Аўстрыя | 65 (83) | ||||||||||
Беларусь | 42 (78) | ||||||||||
Бельгія | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Швейцарыя | 89 (19) | ||||||||||
Чэхія | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Германія | 95 (53) | ||||||||||
Данія | 48 (52) | ||||||||||
Эквадор | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Эстонія | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англія | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Фінляндыя | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Францыя | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Венгрыя | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Сяўбу. Ірландыя | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Нідэрланды | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Нарвегія | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Перу | 0 (36) | ||||||||||
Польшча | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шатландыя | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швецыя | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Славакія | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
уэльс | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Карэя | 46 (26) | ||||||||||
Бразілія | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Кітай | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
В'етнам | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Уганда | 0 (8) |
Дынаміка Генатыпічная складу папуляцый
Змены Генатыпічная складу папуляцый P. infestans могуць адбывацца пад уплывам міграцыі новых клонаў з іншых рэгіёнаў, агратэхнічных прыёмаў (змены гатункаў, прымянення фунгіцыдаў) і ўмоў надвор'я. Вонкавыя ўздзеянні ўплываюць неаднолькава на клоны, якія знаходзяцца на розных этапах жыццёвага цыкла, таму ў папуляцыях штогод працякаюць цыклічныя змены частот генаў, схільных адбору, абумоўленыя зменай пераважнай ролі геннага дрэйфу і адбору.
ўплыў гатунку
Новыя гатункі з эфектыўнымі генамі вертыкальнай устойлівасці (R-генамі) з'яўляюцца магутным селектыўным фактарам, адбірала ў папуляцыях P. infestans клоны з Камплементарнай генамі вірулентнасці. Пры адсутнасцi ў гатункі бульбы неспецыфічнай ўстойлівасці, якая стрымлівае рост папуляцыі патогены, працэс змены дамінуючых у папуляцыі клонаў адбываецца вельмі хутка. Так, пасля распаўсюджвання ў Маскоўскай вобласці гатункі Домодедовская, які мае ген устойлівасці R3, частата клонаў, вірулентныя для гэтага гатунку, за адзін год вырасла з 0,2 да 0,82 (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Аднак змена частот генаў вірулентнасці (патотипов) у папуляцыях адбываецца не толькі пад уплывам гадуюцца гатункаў бульбы. Напрыклад, у Беларусі да 1977 г дамінавалі клоны з генамі вірулентнасці 1 і 4, што было выклікана з вырошчваннем гатункаў бульбы, якія маюць гены ўстойлівасці R1 і R4 (Дарожкін, Бельская, 1979). Аднак у канцы 70-х гадоў ХХ стагоддзя з'явіліся клоны, якія маюць розныя гены вірулентнасці і іх спалучэння, прычым камплементарныя ім гены ўстойлівасці ніколі не былі выкарыстаны ў селекцыі бульбы (лішнія гены вірулентнасці) (Іванюк і інш., 2002). Прычына з'яўлення такіх клонаў, па-відаць, абумоўлена міграцыяй у Еўропу інфекцыйнага матэрыялу з Мексікі з клубнямі бульбы. На радзіме гэтыя клоны развіваліся не толькі на культурным бульбе, але і на дзікіх відах, апорных разнастайныя гены ўстойлівасці, таму спалучэнне ў геноме многіх генаў вірулентнасці было неабходна для выжывання ў тых умовах.
Што тычыцца гатункаў з неспецыфічнай устойлівасцю, то яны, зніжаючы хуткасць размнажэння патогены, затрымліваюць эвалюцыю яго папуляцый, якая, як ужо было сказана, з'яўляецца функцыяй колькасці. Паколькі агрэсіўнасць полигенна, клоны, якія змяшчаюць большая колькасць генаў "агрэсіўнасці", назапашваюцца тым хутчэй, чым вышэй колькасць папуляцыі. Таму высокоагрессивные расы не зьяўляюцца прадуктам адаптацыі да гадуюцца гатункам з неспецыфічнай устойлівасцю, а наадварот, хутчэй выяўляюцца ў пасадкі высоковосприимчивых гатункаў, якія з'яўляюцца назапашвальнікамі спрэчка паразіта.
Так, у Расеі найбольш агрэсіўныя папуляцыі P. Infestans выяўленыя ў зонах штогадовых эпифитотий (папуляцыі з Сахаліна, Ленінградскай, Бранскай абласцей). Агрэсіўнасць гэтых папуляцый апынулася больш высокай, чым мексіканскай (Філіпаў і інш., 2004).
Акрамя таго, у лісці ўстойлівых гатункаў фармуецца менш ооспор, чым у адчувальных (Нanson, Shattock, 1998), гэта значыць неспецыфічныя ўстойлівасць гатунку таксама зніжае рекомбинационные здольнасці паразіта і магчымасць альтэрнатыўных спосабаў зімоўкі.
ўплыў фунгіцыдаў
Фунгіцыды не толькі зніжаюць колькасць фитопатогенных грыбоў, г.зн. ўплываюць на колькасную характарыстыку іх папуляцый, але могуць таксама змяняць частоты асобных генатыпаў, г.зн. ўплываць на якасны склад папуляцый. Сярод найважнейшых паказчыкаў папуляцый, зменлівых пад уплывам фунгіцыдаў можна назваць наступныя: змяненне рэзістэнтнасці да фунгіцыды, змена агрэсіўнасці і вірулентнасці і змяненне сістэм размнажэння.
Ўплыў фунгіцыдаў на рэзістэнтнасць і агрэсіўнасць папуляцый
Ступень падобнага ўплыву вызначаецца, перш за ўсё, тыпам выкарыстоўванага фунгіцыду, якія можна ўмоўна падзяліць на полисайтовые, олигосайтовые і моносайтовые.
Да першых ставіцца большасць кантактных фунгіцыдаў. Рэзістэнтнасць да іх (калі яна магчымая наогул) кантралюецца вялікім лік вельмі слаба экспрэсіўных генаў. Гэтыя ўласцівасці абумоўліваюць адсутнасць бачных змен рэзістэнтнасці папуляцыі пасля апрацоўкі яе фунгіцыдамі (хоць у некаторых эксперыментах некаторае павышэнне рэзістэнтнасці было атрымана). Грыбная папуляцыя, якая захавалася пасля апырсквання кантактнымі фунгіцыдамі, складаецца з дзвюх груп штамаў:
1) Штамы, якія захаваліся на участках раслін, не апрацаваных прэпаратам. Паколькі кантакту з фунгіцыдам не было, агрэсіўнасць і рэзістэнтнасць гэтых штамаў не змяняюцца.
2) Штамы, якія кантактавалі з фунгіцыдаў, канцэнтрацыя якога ў месцах кантакту была ніжэй смяротнай. Як было сказана вышэй, рэзістэнтнасць гэтай частцы папуляцыі таксама не мяняецца, аднак, з прычыны частковага пашкоджвае дзеяння фунгіцыду нават у сублетальной канцэнтрацыі на метабалізм грыбны клеткі, падае агульная прыстасаванасці і яе паразітычны кампанент - агрэсіўнасць (Деревягина, Дзякаў, 1990).
Такім чынам, нават не загінулая частка папуляцыі, падвергнутая кантакту з фунгіцыдаў, мае слабую агрэсіўнасць і не можа быць крыніцай эпифитотии. Таму старанная апрацоўка, якая зніжае частату ня кантактуюць з фунгіцыдам долі папуляцыі - ўмова поспеху ахоўных мерапрыемстваў. Ўстойлівасць да олигосайтовым фунгіцыдамі кантралюецца некалькімі адытыўная генамі.
Мутацыя кожнага гена прыводзіць да некаторага павышэнню рэзістэнтнасці, а агульная ступень рэзістэнтнасці абумоўлена складаннем такіх мутацый. Таму павышэнне рэзістэнтнасці адбываецца ступеніста. Прыкладам ступеністага павелічэння рэзістэнтнасці з'яўляюцца мутацыі ўстойлівасці да фунгіцыдамі диметоморф, шырока якім карыстаецца для абароны бульбы ад фітафтарозу. Ўстойлівасць да диметоморфу полигенна і адытыўная. Одношаговая мутацыя нязначна павышае рэзістэнтнасць.
Кожная наступная мутацыя памяншае памер мішэні і, такім чынам, частату наступных мутацый (Bagirova et al., 2001). Павелічэнне сярэдняй рэзістэнтнасці папуляцыі пасля шматразовых апрацовак олигосайтовым фунгіцыдам адбываецца ступеніста і паступова. Хуткасць гэтага працэсу вызначаецца, па меншай меры, трыма фактарамі: частатой мутирования генаў рэзістэнтнасці, каэфіцыентам рэзістэнтнасці (стаўленнем смяротнай дозы рэзістэнтнасці штаму ў адносінах да адчувальнага) і уплывам мутацый генаў рэзістэнтнасці на прыстасаванасць.
Частата ўзнікнення кожнай наступнай мутацыі ніжэй, чым папярэдняй, таму працэс мае загасальны характар (Bagirova et al., 2001). Аднак, калі ў папуляцыі працякаюць рекомбинационные працэсы (палавой або парасексуальный), то магчыма аб'яднанне ў гібрыдным штам розных мутацый бацькоў і паскарэнне працэсу. Таму панмиксные папуляцыі набываюць рэзістэнтнасць хутчэй агамных, а ў апошніх - папуляцыі, якія не маюць бар'ераў вегетатыўнай несумяшчальнасці, хутчэй, чым папуляцыі, падраздзяленне такімі бар'ерамі. У сувязі з гэтым наяўнасць у папуляцыях штамаў, якія адрозніваюцца тыпамі спарвання, паскарае працэс набыцця рэзістэнтнасці да олигосайтовым фунгіцыдамі.
Другі і трэці фактары не спрыяюць хуткага назапашвання резистетных да диметоморфу штамаў ў папуляцыях. Кожная наступная мутацыя павялічвае рэзістэнтнасць прыкладна ўдвая, што нязначна, і пры гэтым зніжае як хуткасць росту на штучнай асяроддзі, так і агрэсіўнасць (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Можа быць таму сярод прыродных штамаў P. infestans, нават сабраных з апрацаваных диметоморфом пасадак бульбы, практычна няма рэзісцентный.
Папуляцыя, падвергнутая апрацоўцы олигосайтовым фунгіцыдаў, таксама будзе складацца з двух груп штамаў: ня кантактавалі з фунгіцыдаў, і таму не змянілі першапачатковых прыкмет (калі сярод гэтай групы і сустракаюцца резістентные штамы, яны не будуць назапашвацца з прычыны больш высокай агрэсіўнасці і канкурэнтаздольнасці адчувальных штамаў), і штамаў, якія кантактавалі з сублетальными канцэнтрацыямі фунгіцыду. Менавіта сярод апошніх магчымае назапашванне рэзісцентный штамаў, бо тут яны маюць перавагі перад адчувальнымі.
Таму пры выкарыстанні олигосайтовых фунгіцыдаў важная не столькі старанная апрацоўка, колькі высокая канцэнтрацыя прэпарата, у некалькі разоў перавышае смяротную дозу, бо пры ступеністым мутагенеза пачатковая рэзістэнтнасць мутатных штамаў невялікая.
Нарэшце, мутацыі рэзістэнтнасці да моносайтовым фунгіцыдамі высока экспрэсіўныя, гэта значыць адна мутацыя можа паведаміць высокі ўзровень рэзістэнтнасці аж да поўнай страты адчувальнасці. Таму павышэнне рэзістэнтнасці папуляцый адбываецца вельмі хутка.
Прыкладам такіх фунгіцыдаў могуць быць фениламиды, у тым ліку найбольш распаўсюджаны фунгіцыд металаксил. Мутацыі ўстойлівасці да яго ўзнікаюць з высокай частатой, прычым ступень рэзістэнтнасці ў мутантаў вельмі высокая - перавышае адчувальны штам ў тысячу і больш разоў (Деревягина і інш., 1993). Хоць хуткасць росту і агрэсіўнасць рэзісцентный мутантаў зніжаецца на фоне гібелі адчувальных штамаў ад сістэмнага фунгіцыду, колькасць рэзісцентный папуляцыі хутка расце і паралельна павышаецца яе агрэсіўнасць. Таму праз некалькі гадоў выкарыстання фунгіцыду агрэсіўнасць рэзісцентный штамаў можа не толькі зраўняцца з агрэсіўнасцю адчувальных, але і перасягнуць яе (Деревягина, Дзякаў, 1992).
Ўплыў на палавую рэкамбінацыі
Паколькі частая знаходжанне тыпу спарвання А2 у папуляцыях P. infestans супала па часе з інтэнсіўным выкарыстаннем металаксила супраць фітафтарозу, было выказаць здагадку, што металаксил выклікае канверсію тыпаў спарвання. У выгляду P. parasitica такая канверсія пад дзеяннем хлоронеба і металаксила была даказаная эксперыментальна (Да, 1994). Аднакратны пасаж на асяроддзі з нізкай канцэнтрацыяй металаксила прывёў да ўзнікнення гомоталличных изолятов з адчувальнага да металаксилу штаму P. infestans з тыпам спарвання А1 (Savenkova, Cherepnikova-Anikina, 2002). Пры наступных пасажах на асяроддзях з больш высокай канцэнтрацыяй металаксила не ўдалося выявіць ніводнага изолята, які мае тып спарвання А2, аднак большасць изолятов пры скрыжаванні з изолятами А2 замест ооспор фармавалі выродлівыя навалы міцэліем і былі стэрыльнымі. Пасажы рэзістэнтнасці штаму, які мае тып спарвання А2, на асяроддзях з высокай канцэнтрацыяй металаксила дазволілі выявіць тры формы змяненняў тыпу спарвання: 1) поўную стэрыльнасць пры скрыжаванні з изолятами А1 і А2; 2) гомоталлизм (фарміраванне ооспор ў монакультуры); 3) канверсія А2 тыпу спарвання ў А1. Такім чынам, металаксил можа быць прычынай змяненняў тыпаў спарвання ў папуляцыях P. infestans і, такім чынам, праходжання ў іх палавой рэкамбінацыі.
Ўплыў на вегетатыўную рэкамбінацыі
Некаторыя гены рэзістэнтнасці да антыбіётыкаў павялічвалі частату гетерокариотизации гиф і диплоидизации ядраў (Паядынак, Дзякаў, 1981). Як адзначана раней, гетерокариотизация гиф пры зрошчванні розных штамаў P. infestans адбываецца вельмі рэдка з прычыны з'явы вегетатыўнай несумяшчальнасці ў гэтага грыба. Аднак гены ўстойлівасці да некаторых антыбіётыкаў могуць аказваць пабочныя дзеянні, якія выяўляюцца ў пераадоленні вегетатыўнай несумяшчальнасці. Такой уласцівасцю валодаў ген устойлівасці да стрэптаміцын мутанта 1S-1. Наяўнасць падобных мутантаў ў палявых папуляцыях фітафторы можа павялічыць паток генаў паміж штамаў і паскорыць адаптацыю ўсёй папуляцыі да новых гатункам або фунгіцыдамі.
Некаторыя фунгіцыды і антыбіётыкі могуць аказваць уплыў на частату митотической рэкамбінацыі, таксама здольнай змяняць частоты генатыпаў ў папуляцыях. Шырока выкарыстоўваецца фунгіцыд Бэнам звязваецца з бэта-тубулином - бялком, з якога пабудаваны мік- ратрубачкі Цыташкілет, і тым самым парушае працэсы разыходжанні храмасом у анафазе Мітоз, павялічваючы частату митотической рэкамбінацыі (Hastie, 1970 г.).
Такім жа уласцівасцю валодае фунгіцыд пара-фторфенилаланин, які выкарыстоўваецца для лячэння вязаў ад галандскай хваробы. Пара-фторфенилаланин павялічваў частату рэкамбінацыі і ў гетерозиготных диплоидов P. infestans (Паядынак і інш., 1982).
Цыклічныя змены Генатыпічная складу папуляцый ў жыццёвым цыкле P. Infestans
Класічны цыкл развіцця P. infestans ва ўмеранай зоне складаецца з 4-х фаз.
1) Фаза экспанентна росту папуляцыі (поліцыклічныя фаза) з кароткімі генерацыі. Гэтая фаза звычайна пачынаецца ў ліпені і працягваецца 1,5-2 мес.
2) Фаза прыпынку росту колькасці папуляцыі з прычыны рэзкага памяншэння долі непораженные тканіны цi наступлення неспрыяльных умоў надвор'я. Гэтая фаза ў гаспадарках, якія праводзяць своечасовае перадуборачны выдаленне бацвіння, выпадае з гадавога цыклу.
3) Фаза зімоўкі ў клубнях, якая суправаджаецца значным змяншэннем колькасці папуляцыі з прычыны выпадковага заражэння клубняў, павольнага развіцця ў іх інфекцыі, адсутнасці пры нармальных рэжымах захоўвання перезаражения клубняў, сгнивания і выбракоўвання здзіўленых клубняў.
4) Фаза маруднага развіцця ў глебе і на ўсходах (моноциклическая фаза), пры якой працягласць генерацыі можа дасягаць месяца і больш (канец траўня - пачатак ліпеня). Звычайна ў гэты час хворыя лісце цяжка выявіць нават пры спецыяльных назіраннях.
Фаза экспанентна росту папуляцыі (поліцыклічныя фаза)
Шматлікія назіранні (Пшедецкая, Козубова, 1969; Барысёнак, 1969; Оша, 1969; Дзякаў, Супрун 1984; Рыбакова, Дзякаў, 1990) паказалі, што ў пачатку эпифитотии пераважаюць маловирулентные і слабоагрессивные клоны, якія ў далейшым замяняюцца больш вірулентнасці і агрэсіўнымі, прычым хуткасць росту агрэсіўнасці папуляцыі тым вышэй, чым менш ўстойлівы гатунак расліны-гаспадара.
Па меры росту колькасці папуляцыі павялічваецца канцэнтрацыя як селектыўна-важных генаў, уведзеных у камерцыйныя гатункі (R1-R4), так і селектыўна нейтральных (R5-R11). Так, у падмаскоўных папуляцыях ў 1993 г. сярэдняя вірулентнасць з канца ліпеня да сярэдзіны жніўня вырасла з 8,2 да 9,4, прычым найбольшы рост назіраўся для селектыўна нейтральнага гена вірулентнасці R5 (з 31 да 86% вірулентныя клонаў) (Смірноў, 1996. ).
Памяншэнне хуткасці росту папуляцыі суправаджаецца зніжэннем паразітычнай актыўнасці папуляцыі. Таму ў дэпрэсіўныя гады як агульная колькасць рас, так і доля высоковирулентных рас ніжэй, чым у эпифитотийные (Барысёнак, 1969). Калі ў разгар эпифитотии ўмовы надвор'я змяняюцца на неспрыяльныя для фітафтарозу і памяншаецца здзіўленага бульбы, то канцэнтрацыя высоковирулентных і агрэсіўных клонаў таксама памяншаецца (Рыбакова і інш., 1987).
Павелічэнне частот генаў, якія ўплываюць на вірулентнасць і агрэсіўнасць папуляцыі, магчыма, адбываецца з прычыны адбору больш вірулентныя і агрэсіўных клонаў у змяшанай папуляцыі. Для дэманстрацыі адбору распрацаваны метад аналізу нейтральных мутацый, з поспехам выкарыстаны ў хемостатных папуляцыях дрожджаў (Adams et al., 1985) і Fusarium graminearum (Wiebe et al. 1995).
Частата мутантаў, устойлівых да бластицидину S, у палявой папуляцыі P. infestans падала паралельна росту агрэсіўнасці папуляцыі, што сведчыць аб змене дамінуючых клонаў у працэсе росту колькасці папуляцыі (Рыбакова і інш., 1987).
Фаза зімоўкі ў клубнях
У працэсе зімоўкі ў клубнях бульбы вірулентнасць і агрэсіўнасць штамаў P. infestans падаюць, прычым падзенне вірулентнасці адбываецца павольней, чым агрэсіўнасці (Рыбакова, Дзякаў, 1990). Па-відаць, ва ўмовах, якія спрыяюць хуткаму росту колькасці папуляцыі (r-адборы), «лішнія» гены вірулентнасці і высокая агрэсіўнасць аказваюцца карыснымі, таму развіццё эпифитотии суправаджаецца адборам найбольш вірулентныя і агрэсіўных клонаў. Ва ўмовах насычэння асяроддзя, калі вялікую ролю набывае не хуткасць размнажэння, а ўстойлівасць існавання ў неспрыяльных умовах (К-адбор), «лішнія» гены вірулентнасці і агрэсіўнасць зніжаюць прыстасаванасць, і клоны, якія маюць гэтыя гены, першымі выміраюць, так што сярэдняя агрэсіўнасць і вірулентнасць папуляцыі падае.
Фаза вегетацыі ў глебы
Гэтая фаза - самая загадкавая ў жыццёвым цыкле (Andrivon 1995). Яе існаванне пастулявалі чыста абстрактна - з прычыны адсутнасці звестак аб тым, што адбываецца з патагенаў на працягу доўгага тэрміну (часам - больш за месяц) - ад з'яўлення ўсходаў бульбы да ўзнікнення на іх першых плям хваробы. На аснове назіранняў і эксперыментаў было рэканструявана паводзіны грыба ў гэтым перыядзе жыцця (Hirst, Stedman, 1960 г.; Багуслаўская, Філіпаў, 1976).
На заражаных клубнях ў глебе можа фармавацца спороношение грыба. Якія ўтвараюцца спрэчкі прарастаюць гифами, якія могуць доўга вегетировать ў глебе. Першасныя (ўтварыліся на клубнях) і другасныя (на міцэліем ў глебе) спрэчкі капілярнае токамі паднімаюцца на паверхню глебы, але набываюць здольнасць заражаць бульба толькі пасля таго, як яго ніжнія лісце апусцяцца і прыйдуць у кантакт з паверхняй глебы. Такое лісце (а менавіта на іх выяўляюць першыя плямы хваробы) фармуюцца не адразу, а пасля працяглага росту і развіцця бацвіння бульбы.
Такім чынам, у жыццёвым цыкле P. Infestans можа існаваць і фаза сапротрофной вегетацыі. Калі ў паразітычнай фазе жыццёвага цыкла агрэсіўнасць з'яўляецца найважнейшым кампанентам прыстасаванасці, то ў сапротрофной фазе адбор накіраваны на зніжэнне паразітычных уласцівасцяў, як гэта паказана эксперыментальна для некаторых фитопатогенных грыбоў (гл. Carson, 1993). Таму ў дадзенай фазе цыкла агрэсіўныя ўласцівасці павінны губляцца найбольш інтэнсіўна. Але пакуль прамых эксперыментаў, якія пацвярджаюць выказаныя здагадкі, не праведзена.
Сезонныя змены закранаюць не толькі патагенныя ўласцівасці P. infestans, але і рэзістэнтнасць да фунгіцыды, якая ў поліцыклічныя фазе (у перыяд эпифитотий) расце, а ў перыяд зімовага захоўвання - падае (Деревягина і інш., 1991; Kadish, Cohen, 1992). Асабліва інтэнсіўнае падзенне рэзістэнтнасці да металаксилу назіралася ў перыяд паміж высадкай здзіўленых клубняў і з'яўленнем першых плям хваробы ў поле.
Унутрывідавая спецыялізацыя і яе эвалюцыя
P. infestans выклікае эпідэміі на двух камерцыйна важных культурах - бульбе і тамаце. Эпифитотии на бульбе пачаліся неўзабаве пасля траплення грыба ў новыя раёны. Паражэнне тамата было адзначана таксама неўзабаве пасля з'яўлення інфекцыі на бульбе, але эпифитотии на тамаце былі адзначаны толькі праз сто гадоў - у сярэдзіне ХХ стагоддзя. Вось што пішуць пра паразу таматаў у ЗША Галлегли і Нидерхаузер
(1962): «На працягу прыкладна 100 гадоў пасля моцнай эпифитотии 1845 г. мала ці амаль зусім не рабілася спробаў атрымання ўстойлівых гатункаў тамата. Хоць упершыню фітафтароз зарэгістраваны на таматах яшчэ ў 1848 г., ён не стаў на гэтым раслін аб'ектам сур'ёзнай увагі селекцыянераў аж да моцнай ўспышкі хваробы ў 1946 г. ". На тэрыторыі Расіі фітафтароз тамата быў зарэгістраваны яшчэ ў XIX стагоддзі. «На гэта захворванне доўгі час даследчыкі не звярталі ўвагі, бо яно не прычыняла істотнага эканамічнага ўрону. Але ў 60-70х гг. XX стагоддзя эпифитотии фітафтарозу на тамаце назіраюцца і ў Савецкім Саюзе, галоўным чынам у Ніжнім Паволжы, на Украіне, Паўночным Каўказе, у Малдавіі ... »(Балашова, 1979).
З тых часоў паразы тамата фітафтароз сталі штогадовымі, распаўсюдзіліся па ўсёй тэрыторыі прамысловага і прысядзібнага культывавання і выклікаюць вялікую эканамічную шкоду гэтай культуры. Што ж адбылося? Чаму першае з'яўленне паразіта на бульбе і эпифитотийное паражэнне гэтай культуры адбыліся амаль адначасова, а для ўзнікнення эпифитотии на тамаце спатрэбілася стагоддзе? Гэтыя адрозненні сведчаць на карысць мексіканскага, а не паўднёваамерыканскага крыніцы інфекцыі. Калі від Phytophthora infestans сфармаваўся як паразіт мексіканскіх клубненосный відаў роду Solanum, то зразумела, чаму гэтак моцна ўразіўся культурны бульба, які адносіцца да той жа секцыі роду, што і мексіканскія віды, але з прычыны адсутнасці коэволюции з паразітам, не выпрацавалі механізмаў спецыфічнай і неспецыфічнай устойлівасці.
Тамат ставіцца да іншай секцыі роду, тып яго абмену мае істотныя адрозненні ад клубненосный відаў, таму, нягледзячы на тое, што тамат ня знаходзіцца па-за межамі харчовай спецыялізацыі P. infestans, інтэнсіўнасць яго паражэння была недастатковай для сур'ёзных эканамічных страт.
Узнікненне эпифитотий на тамаце абумоўлена сур'ёзнымі генетычнымі зменамі паразіта, павысіў яго прыстасаванасць (патагенных) пры Паразітаванне. Мы лічым, што новая, спецыялізаваная для паразітавання на тамаце форма - гэта апісаная М. Галлегли раса Т1, якая дасягаюць гатункі вишневидного тамата (Red Cherry, Ottawa), устойлівага да распаўсюджанай на бульбе расе Т0 (Gallegly, 1952). Па-відаць, мутацыя (або серыя мутацый), якая ператварыла расу Т0 у расу Т1 і прывяла да з'яўлення клонаў, высока прыстасаваных да паразы тамата. Як часта здараецца, павышэнне патагеннасці да аднаго гаспадару суправаджалася паніжэннем яе да іншага, гэта значыць паўстала пачатковая, пакуль не поўная унутрывідавая спецыялізацыя - да бульбы (раса Т0) і да таматы (раса Т1).
Якія сведчанні на карысць гэтай здагадкі?
- Встречаемості на бульбе і тамаце. На лісці тамата раса Т1 пераважае, у той час як на лісці бульбы яна сустракаецца рэдка. Па дадзеных С.Ф.Багировой і Т.А. Орешонковой (не апублікавана) у Маскоўскай вобласці ў 1991-1992 гг встречаемості расы Т1 ў пасадкі бульбы склала 0%, а ў пасадкі тамата - 100%; у 1993-1995 гг - 33% і 90% адпаведна; у 2001 г - 0% і 67%. Cходные дадзеныя атрыманы і ў Ізраілі (Cohen, 2002). Эксперыменты з заражэннем клубняў бульбы изолятами расы Т1 і сумессю изолятов Т0 і Т1 паказалі, што изоляты расы Т1 дрэнна захоўваюцца ў клубнях і выцясняюцца изолятами расы Т0 (Дзякаў і інш., 1975; Рыбакова, 1988).
2) Дынаміка расы Т1 ў пасадках тамата. Першаснае заражэнне лісця тамата ажыццяўляецца изолятами расы Т0, якія дамінуюць пры аналізе інфекцыі ў першых плямах, якія ўтвараюцца на лісці. Гэта пацвярджае агульнапрынятую схему міграцыі паразіта: Асноўны масіў інфекцыі з бульбы складае раса Т0, аднак нязначная колькасць клонаў расы Т1, якія захаваліся ў бульбе, патрапіўшы на тамат выцясняюць расу Т0 і назапашваюцца да канца эпифитотии. Магчыма і наяўнасць альтэрнатыўнага крыніцы інфекцыі лісця тамата расой Т1, не гэтак магутнага, як бульбяныя клубні і лісце, але сталага. Таму на генетычную структуру папуляцыі, заражаў тамат, гэты крыніца ўплывае слаба, але ў далейшым абумоўлівае назапашванне расы Т1 (Рыбакова, 1988; Дзякаў і інш., 1994).
3) Агрэсіўнасць да бульбы і таматы. Штучнае заражэнне лісця тамата і бульбы изолятами рас Т0 і Т1 паказала, што першыя больш агрэсіўныя для бульбы, чым для тамата, а другія больш агрэсіўныя для тамата, чым для бульбы. Гэтыя адрозненні выяўляюцца ў выцясненні изолятов не «сваёй» расы з змяшанай папуляцыі пры пасажах на лісці ў цяпліцы (Дзякаў і інш., 1975) і ў палявых дзялянках (Leberton et al., 1999); адрозненнях ў мінімальнай інфекцыйнай нагрузцы, латэнтным перыядзе, памеры інфекцыйных плям і споравай прадукцыі (Рыбакова, 1988; Дзякаў і інш., 1994.; Legard et al. 1995; Forbes et al., 1997.; Oyarzun et al., 1998.; Leberton et al. 1999; Vega-Sanchez et al., 2000.; Knapova, Gisi 2002; Sussuna et al., 2004).
Агрэсіўнасць изолятов расы Т1 да гатункаў тамата, якія не маюць генаў устойлівасці, настолькі высокая, што гэтыя изоляты спороносят на лісці як на пажыўнай асяроддзі без некротизации заражанай тканіны (Дзякаў і інш., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) вірулентнасці для бульбы і тамата. Раса Т1 дзівіць гатункі вишневидного тамата, якія валодаюць геном ўстойлівасці Ph1, а раса Т0 не здольная паражаць гэтыя гатункі, г.зн. валодае больш вузкай вірулентнасці. У адносінах да дифференциаторам
R-генаў бульбы назіраецца зваротная залежнасць, г.зн. штамы, выдзеленыя з лісця тамата менш вірулентнасці, чым «бульбяныя» штамы (табл. 11).
5) Нейтральныя маркеры. Аб разнонаправленным унутрывідавых адборы сведчыць і аналіз нейтральных маркераў у папуляцыях P. infestans, якія паразітуюць на бульбе і тамаце. У бразільскіх папуляцыях P. infestans изоляты з лісця тамата належалі да клонально лініі US-1, а з лісця бульбы - да лініі BR-1 (Suassuna et al., 2004). У Фларыдзе (ЗША) на бульбе з 1994 г. пачаў дамінаваць (встречаемості больш за 90%) клон US-8, а на тамаце - клоны US-11 і US-17, прычым изоляты апошняга больш агрэсіўныя для тамата, чым для бульбы (Weingartner , Tombolato, 2004). Пэўныя адрозненні частот генатыпаў (фингерпринтов ДНК) у изолятов з бульбы і тамата ўстаноўлены для 1200 штамаў P. infestans, сабраных у ЗША з 1989 па 1995 гады (Deahl et al. 1995).
Выкарыстанне метаду AFLP дазволіла падзяліць 74 штаму, сабраных з лісця бульбы і тамата ў 1996-1997 гг. у Францыі і Швейцарыі, на 7 груп. Штамы з бульбы і тамата выразна не разышліся, але «бульбяныя» штамы апынуліся генетычна больш разнастайныя, чым «таматавыя». Першыя сустракаліся ва ўсіх сямі кластарах, а другія - толькі ў чатырох, што сведчыць пра больш спецыялізаваным геноме апошніх (Knapova, Gisi, 2002).
6) Механізмы ізаляцыі. Калі папуляцыі паразіта на двух відах раслін-гаспадароў эвалюцыянуюць у кірунку звужэння спецыялізацыі да «свайму» гаспадару, то ўзнікаюць розныя пера- і постмейотические механізмы, якія перашкаджаюць межпопуляционным генетычным абменах (Дзякаў, Лекомцева, 1984).
У некалькіх працах было даследавана ўплыў крыніцы бацькоўскіх штамаў на эфектыўнасць гібрыдызацыі. Пры скрыжаванні штамаў, ізаляваных з розных відаў роду Solanum ў Эквадоры (Oliva et al., 2002), было ўстаноўлена, што штамы з тыпам спарвання А2 з дзікіх пасленовых (клонально лінія ЕС-2) горш за ўсё скрыжоўваюцца са штамамі з тамата (лінія ЕС -3), а найбольш эфектыўна скрыжоўваюцца са штамам з бульбы (ЕС-1).
Усе гібрыды апынуліся непатогенный. Аўтары мяркуюць, што нізкі працэнт гібрыдызацыі і рэдукцыя патагеннасці у гібрыдаў абумоўлены постмейотическими механізмамі рэпрадуктыўнай ізаляцыі папуляцый.
У досведах Багірава з суаўтарамі (1998) было праведзена скрыжаванне вялікай колькасці штамаў з бульбы і тамата, якія маюць ўласцівасці рас Т0 і Т1. Найбольш высокофертильными апынуліся кросы штамаў Т1хТ1, вылучаных з тамата (36 ооспор ў поле зроку мікраскопа, 44% прарастання ооспор), найменш эфектыўнымі - скрыжавання рас Т0хТ1, выдзеленых з розных гаспадароў (нізкая лік фармуюцца і прарослых ооспор, высокая доля абартыўна і недаразвітых ооспор) . Эфектыўнасць кросаў паміж изолятами расы Т0, вылучанымі з бульбы, апынулася прамежкавай. Паколькі асноўны масіў штамаў расы Т0 дзівіць бульбу, яна мае надзейная крыніца зімоўкі - бульбяныя клубні, з прычыны чаго значэнне ооспор як зімуюць інфекцыйных адзінак для папуляцый з бульбы невысока. Адаптаваная «таматная форма» здольная зімаваць на тамаце ў форме ооспор (гл. Ніжэй) і таму захоўвае больш высокую прадуктыўнасць палавога працэсу. За кошт высокай фертыльнасці Т1 набывае самастойны патэнцыял першаснай інфекцыі на тамаце. Такім жа чынам можна інтэрпрэтаваць вынікі, атрыманыя Кнаповой з суаўтарамі (Knapova et al., 2002). Кросы штамаў, вылучаных з бульбы з штамамі з тамата, далі найвышэйшае лік ооспор - 13,8 на кв.мм. асяроддзя (з роскідам 5-19) і прамежкавы працэнт прарастання ооспор (6,3 з роскідам 0-24). Скрыжавання штамаў, ізаляваных з тамата, далі найменшы працэнт ооспор (7,6 з роскідам 4-12) пры найвышэйшым адсотку іх прарастання (10,8). Кросы паміж штамамі, вылучанымі з бульбы, далі прамежкавае лік ооспор (8,6 з высокім роскідам дадзеных - 0-30) і найменшы працэнт прарастання ооспор (2,7). Такім чынам, штамы з бульбы менш фертыльнасць, чым з тамата, але межпопуляционные скрыжавання далі не горшыя вынікі, чым унутрыпапуляцыйных. Магчыма, адрозненні з прыведзенымі вышэй дадзенымі Багірава з суаўт. тлумачацца тым, што расійскія даследчыкі працавалі з штамамі, ізаляванымі ў пачатку 90-х гадоў ХХ стагоддзя, а швейцарскія - з штамамі, ізаляванымі ў канцы 90-х гг.
У аснове нізкай фертыльнасці можа лежатьгетероплоидность штамаў. Калі ў Мексіканскіх папуляцыях, дзе палавой працэс і першаснае заражэнне ооспоровым нашчадствам рэгулярныя, большасць даследаваных штамаў P. Infestans дыплоідным, то ў краінах Старога Свету назіраецца унутрыпапуляцыйных палімарфізм плоидности (ды-, тры-і тетраплоидные штамы, а таксама гетерокариотические штамы з гетероплоидными ядрамі) , прычым штамы, якія маюць розныя тыпы спарвання, г.зн. узаемна фертыльнасць, адрозніваюцца плоидностью ядраў (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett 1995). Разноплоидность ядраў у антеридиях і оогониях можа быць прычынай нізкай фертыльнасці.
Што датычыцца ядзерных абменаў паміж гифами пры анастомоз, то гэтаму перашкаджае вегетатыўная несумяшчальнасць, якая разбівае бясполае папуляцыі на мноства генетычна ізаляваных клонаў (Паядынак, Дзякаў, 1987; Горбунова і інш., 1989; Анікін і інш., 1997b).
7) Канвергенцыя папуляцый. Прыведзеныя вышэй дадзеныя сведчаць аб тым, што гібрыдызацыя паміж «бульбянымі» і «таматная» штамамі P. infestans магчымыя. Таксама магчыма рэцыпрокнай перезаражение розных гаспадароў, хоць і з паніжанай агрэсіўнасцю.
Даследаванне папуляцыйных маркераў у изолятов з размешчаных побач палёў бульбы і тамата ў 1993 г паказала, што прыкладна чвэрць изолятов, выдзеленых з лісця тамата, быў перанесены з суседняга бульбянога поля (пазыковая і інш., 1997). Тэарэтычна можна было меркаваць, што дывергенцыя папуляцый на двух гаспадарах будзе ўзмацняцца і прывядзе да ўзнікнення унутрывідавых спецыялізаваных формаў (f.sp. potato і f.sp. tomato), тым больш што ооспоры могуць захоўвацца ў раслінных рэштках (Drenth et al. 1995 ; Багірава, Дзякаў, 1998) і насенні тамата (Rubin et al., 2001). Такім чынам, таматы маюць у цяперашні час незалежны ад клубняў бульбы крыніца вясновага аднаўлення.
Аднак усё адбылося інакш. Зімоўка ооспоры дазволіла паразіту пазбегнуць самага вузкага этапу ў яго жыццёвым цыкле - моноциклическую стадыю вегетацыі ў глебе, пры якой зніжаюцца паразітычныя ўласцівасці, паступова аднаўляецца летам у поліцыклічныя фазе.
Табліца 11. Частоты генаў вірулентнасці да гатункаў-дифференциаторам бульбы ў штамаў P. Infestans
Краіна | Год | Сярэдні лік генаў вірулентнасці у штамаў | Аўтар | |
з бульбы | з тамата | |||
Францыя | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al. 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998. | |
Францыя, Швейцарыя | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi 2002 |
ЗША | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al. 1995 |
ЗША, Зап. Вашынгтон | 1996 | 4.6 | 5 | Дорранс і інш., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Эквадор | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998. |
Ізраіль | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Расія, Моск. вобл. | 1993 | 8.9 | 6.7 | Смірноў, 1996. |
Расія, розныя вобласці | 1995 | 9.4 | 8 | Казлоўская і інш. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Першасныя зооспорангии і зооспоры, якімі прарастаюць ооспоры, валодаюць высокай ступенню паразітычнай актыўнасці, асабліва калі ооспоры сфармаваліся партеногенетически пад уплывам феромонов штаму, які валодае процілеглым тыпам спарвання. Таму інфекцыйны матэрыял на ўсходах тамата, які вырас з заражаных ооспоры насення, высока патагенны як для тамата, так і для бульбы.
Гэтыя змены прывялі да чарговай папуляцыйнай перабудове, якая выказалася ў наступных важных з эпідэміялагічнага пункту гледжання пераменах:
- Заражаныя ўсходы тамата сталі важнай крыніцай першаснага заражэння бульбы (Філіпаў, Іванюк, асабістыя паведамленні).
- Эпифитотии на бульбе сталі назірацца ўжо ў чэрвені, прыкладна на месяц раней, чым звычайна.
- У пасадках бульбы павялічыўся адсотак расы Т1, якая раней сустракалася там у нязначнай колькасці (Уланава і інш., 2003 г.).
- Штамы, ізаляваныя з лісця тамата, перасталі адрознівацца ад штамаў з бульбы па вірулентнасці на бульбяных дифференциаторах генаў вірулентнасці і сталі пераўзыходзіць «бульбяныя» штамы па агрэсіўнасці не толькі на тамаце, але і на бульбе (Лаўрова і інш., 2003; Уланава і інш. 2003).
Такім чынам, замест дывергенцыі адбылася канвергенцыя папуляцый ўзнікненне адзінай папуляцыі на двух раслінах-гаспадарах з высокай вірулентнасці і агрэсіўнасцю да абодвух відах.
Заключэнне
Такім чынам, нягледзячы на больш чым 150-гадовае інтэнсіўнае вывучэнне P. infestans, у біялогіі, у тым ліку, папуляцыйнай біялогіі гэтага ўзбуджальніка найважнейшых хвароб культывуюцца пасленовых раслін, застаецца шмат невядомага. Незразумела, як уплывае на структуру папуляцый праходжанне асобных этапаў жыццёвага цыклу, якія генетычныя механізмы каналізаванае зменлівасці агрэсіўнасці і вірулентнасці, якімі суадносіны палавой і клонально сістэм размнажэння ў прыродных папуляцыях, як атрымліваецца ў спадчыну вегетатыўная несумяшчальнасць, якая роля бульбы і тамата ў першасным заражэнні гэтых культур і ў чым заключаецца іх уплыў на структуру папуляцый паразіта. Да гэтага часу не вырашаны такія найважнейшыя для практычнай дзейнасці пытанні, як генетычныя механізмы змены агрэсіўнасці паразіта або эрозія неспецыфічнай ўстойлівасці бульбы. Па меры паглыблення і пашырэння даследаванняў фітафтарозу бульбы паразіт ставіць перад даследчыкамі ўсё новыя задачы. Аднак ўдасканаленне эксперыментальных магчымасцяў, ўзнікненне новых метадалагічных падыходаў маніпуляцыі з генамі і вавёркамі дазваляюць спадзявацца на паспяховае вырашэнне пастаўленых пытанняў.
Артыкул апублікаваная ў часопісе «Абарона бульбы» (№3, 2017)