А.М. Чудзінава, В.А. Платонаў, А.В. Аляксандрава, С.Н. Еланский
Нядаўна было паказана, што грыб-аскомицет Ilyonectria crassa здольны паражаць клубні бульбы. У працы ўпершыню прааналізаваны біялагічныя асаблівасці і ўстойлівасць да некаторых фунгіцыдамі вылучанага з бульбы штаму I. crassa. Паслядоўнасці видоспецифичных участкаў "бульбянога" штаму супалі з атрыманымі раней для грыбоў, выдзеленых з каранёў нарцыса, жэньшэня, асіны і бука, цыбулін лілеі і ліста цюльпана. Па-відаць, многія дзікарослыя і садовыя расліны могуць быць рэзерват I. crassa. Доследны штам заражаў лустачкі тамата і бульбы, але не інфікаваў цэлы плод тамата і непашкоджаны клубень бульбы. Гэта паказвае, што I. crassa з'яўляецца раневых паразітам. Ацэнка ўстойлівасці да флудиоксонилу, дифеноконазолу і азоксистробину на пажыўнай асяроддзі паказала высокую эфектыўнасць гэтых прэпаратаў.
Паказчык ЕС50 (канцэнтрацыя фунгіцыду, запавольвацца ў 2 разы хуткасць радыяльнага прыросту калоніі адносна бесфунгицидного кантролю) быў роўны 0.4; 7.4 і 4 мг / л адпаведна. Магчымасць развіцця захворвання, выкліканага I. crassa, варта ўлічваць пры фитопатологической ацэнцы клубняў бульбы і распрацоўцы мерапрыемстваў па абароне раслін.
Развіццё фитопатогенных мікраарганізмаў прыводзіць да высокіх страт на ўсіх этапах вырошчвання і захоўвання бульбы. Пры планаванні ахоўных мерапрыемстваў ўлічваюцца, як правіла, добра вядомыя ўзбуджальнікі хвароб, такія як віды родаў Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora і інш. Аднак у апошнія гады з'яўляецца ўсё больш паведамленняў аб з'яўленні на бульбе новых фитопатогенных мікраарганізмаў. Іх біялогія слаба вывучана, эфектыўнасць выкарыстоўваюцца на бульбе фунгіцыдаў ў дачыненні да іх невядомая, метады дыягностыкі не распрацаваны. Пры масавым развіцці яны здольныя нанесці адчувальны ўрон ўраджаю бульбы. Адным з такіх мікраарганізмаў з'яўляецца грыб-аскомицет Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, упершыню выяўлены аўтарамі на клубнях бульбы (Chudinova et al., 2019).
У дадзенай працы прыведзены вынікі аналізу вылучанага з клубня бульбы штаму I. crassa. Вывучаны марфалогія калоній і мицелиальных структур I. crassa, паслядоўнасці нуклеатыдаў видоспецифичных участкаў ДНК, вірулентнасць да бульбы і таматы, ўстойлівасць да некаторых папулярным фунгіцыдамі.
Матэрыялы і метады
У працы выкарыстаны штам I. crassa 18KSuPT2, вылучаны у 2018 годзе з здзіўленага клубня бульбы, вырашчанага ў Кастрамской вобласці. Клубень быў уражаны па тыпу сухі гнілі з паражніной, пакрытай светла-карычневым міцэліем. З дапамогай стэрыльнай препаровальной іголкі міцэліем грыба пераносілі ў кубак Петры з агаризованной асяроддзем (піўное сусло 10%, агар 1.5%, пеніцылін 1000 адз / мл). Інкубаваць кубкі ў цемры пры 24 ° C.
Для фатаграфавання, ацэнкі памераў і марфалогіі спрэчка і органаў спороношения выкарыстоўвалі светлавы мікраскоп Leica DM2500 c лічбавай камерай ICC50 HD і бінакулярны мікраскоп Leica M80 з лічбавай камерай IC80HD (Leica Microsystems, Германія).
Для вылучэння ДНК міцэліем грыба нарошчвалі ў вадкай гарохавай асяроддзі, пасля чаго замарожвалі ў вадкім азоце, гомагенізаваных, інкубаваць ў ставіш буферы, чысцілі хлараформам, 2 разы прамывалі 70% спіртам.
Падрабязна метад выдзялення ДНК апісаны ў артыкуле Kutuzova et al. (2017).
Для вызначэння відавы прыналежнасці малекулярнымі метадамі і параўнання з іншымі вядомымі штамамі I. crassa праводзілі ПЦР з праймер, якія дазваляюць амплифицировать видоспецифичные ўчасткі ДНК: ITS1-5,8S-ITS2 (праймер ITS5 / ITS4, White et al., 1990), ўчасткі генаў b -тубулина (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson 1995) і фактару элангацыях трансляцыі 1α (tef1α) (праймер EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999). Ампликоны патрэбнай даўжыні экстрагаваныя з геля з дапамогай набору CleanUp кампаніі «Евроген». Амплифицированные ўчасткі секвенировали з выкарыстаннем набору рэактываў BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) на аўтаматычным секвенаторе Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Атрыманыя паслядоўнасці нуклеатыдаў выкарыстоўвалі для пошуку адпаведнасці ў базе дадзеных GenBank Нацыянальнага цэнтра біятэхналагічнай інфармацыі ЗША (NCBI). Філагенетычна аналіз праводзілі з дапамогай праграмы MEGA 6 (Tamura et al., 2013 года).
Вызначэнне вірулентнасці праводзілі на цэлых зялёных плёне крупноплодная тамата (гатунак Дубрава) і клубнях бульбы (гатунак Гала). Акрамя таго, для імітацыі паразы пашкоджаных плёну і клубняў выкарыстоўвалі дзелькі тых жа пладоў і клубняў. Лустачкі клубняў змяшчалі ў вільготныя камеры, якія ўяўляюць сабой кубкі Петры з мокрай фільтравальнай паперай на дне. На паперу змяшчалі прадметнае шкло, на якое, у сваю чаргу, клалі лустачкі клубняў або пладоў. Цэлыя клубні і плады таксама змяшчалі ў кантэйнеры, на дне якіх была мокрая фільтравальнай папера. У цэнтр лустачкі (або на непашкоджаную паверхню клубня або плёну) змяшчалі кавалачак агара (5 × 5 мм) з гифами грыба пасля 5 дзён вырошчвання на сусло-агар.
Ацэнку ўстойлівасці штамаў грыбоў да фунгіцыдамі праводзілі ў лабараторных умовах на агаризованной пажыўнай асяроддзі. Вывучалі ўспрымальнасць да фунгіцыдным прэпаратаў Максім, КС (дзеючае рэчыва флудиоксонил, 25 г / л), Квадрис, КС (азоксистробин 250 г / л), Хутка, КЭ (дифеноконазол 250 г / л) (Дзяржаўны каталог ..., 2020). Ацэнку праводзілі ў кубках Петры на асяроддзі сусло-агар з даданнем доследных прэпаратаў у канцэнтрацыях дзеючага рэчыва 0.1; 1; 10 ppm (мг / л) (для флудиоксонила і дифеноконазола), 1; 10; 100 ppm (для азоксистробина) і на асяроддзі без фунгіцыду (кантроль). Фунгіцыд дадавалі ў расплаўленую і астуджаную да 60 ° C сераду, пасля чаго сераду разлівалі па кубках Петры. Агаровый блок з міцэліем грыба змяшчалі ў цэнтр кубкі Петры і культывавалі пры тым-тэмпературах 24 ° C у цемры. Праз 7 сутак инкубирования праводзілі замер дыяметраў калоній у двух узаемна перпендыкулярных кірунках; вынікі вымярэнняў для кожнай калоніі усредняет. Эксперыменты выконвалі ў трох паўторна. Па выніках аналізаў разлічвалі паказчык EC50, роўны канцэнтрацыі фунгіцыду, якая зніжае у 2 разы хуткасць радыяльнага прыросту калоніі адносна бесфунгицидного кантролю.
Вынікі і абмеркаванне
На кубках Петры з сусло-агаром грыб утвараў калоніі з белым хлопьевидным міцэліем. Серада пад міцэліем афарбоўвацца ў чырвона-карычневы колер. Пры падсыхання асяроддзя грыб фармаваў спрэчкі двух тыпаў на адзіночных і агрэгаваных ў невялікія спородохии конидиеносцах. Макроконидии выцягнутыя, цыліндрычныя, з адной-трыма септами, сярэдняя даўжыня 27.2 мкм з роскідам значэнняў ад 23.2 да 32.2 мкм, шырыня - да 4.9 мкм (мал. 1). Сярэдняя даўжыня микроконидий - 14.3 мкм з роскідам значэнняў ад 10.3 да 18.1 мкм, шырыня - да 4.0 мкм. Усе макра- і микроморфологические прыкметы ўкладваюцца ў дыяпазон вар'іравання выгляду Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Паслядоўнасці видоспецифичных участкаў ДНК (ITS, b-тубулин, TEF 1α) цалкам супалі з сиквенсами раней даследаваных намі штамаў I. crassa (Chudinova et al., 2019, табл. 1). З мэтай вывучэння распаўсюджанасці I. crassa ў іншых рэгіёнах і аналізу спектру пабіваюць культур былі прааналізаваныя аналагічныя паслядоўнасці ДНК у базе GenBank (табл. 1). Перакрыцце склала ад 86 да 100%. Сиквенсы ўсіх трох участкаў ДНК "бульбянога" штаму I. crassa былі ідэнтычныя паслядоўнасцях штамаў, выдзеленых з цыбуліны лілеі і каранёў нарцыса у Нідэрландах і з кораня жэньшэня ў Канадзе. Іншых штамаў I. crassa з трыма прааналізаваць аналагічнымі паслядоўнасцямі ў адкрытых базах дадзеных нам выявіць не ўдалося. Аднак аналіз дэпанаваных паслядоўнасцяў ITS і b-тубулина паказаў прысутнасць I. crassa на лісці цюльпана ў Вялікабрытаніі. Грыбы з падобнай паслядоўнасцю ITS былі выяўлены пры аналізе микобиоты каранёў асіны ў Канадзе і бука ў Італіі, клубняў бульбы ў Саудаўскай Аравіі (табл. 1). Вынікі гэтага даследавання паказваюць, што I. crassa мае глабальнае распаўсюджванне і здольны паражаць розныя віды раслін.
Пры вызначэнні патагеннасці на кавалках тамата і бульбы на 5 дзень дыяметр паразы дасягаў 1.5 см. Пры гэтым доследны штам ня інфікаваў цэлы плод тамата і непашкоджаны клубень бульбы. Аднак на тамаце назіралася паражэнне чашалісцікаў. Для выключэння магчымасці кантамінацыі з развіўся на лустачкі клубня бульбы міцэліем быў выдзелены ў чыстую культуру ізалят грыба. Ён быў цалкам ідэнтычны бацькоўскаму штамы. Па-відаць, I. crassa з'яўляецца раневых паразітам.
Предпосадочная апрацоўка насенных клубняў фунгіцыдамі дазваляе знізіць развіццё хвароб на раслінах падчас вегетацыі. Для падбору эфектыўных фунгіцыдаў важна ацаніць, якія з іх эфектыўныя ў адносінах да I. сrassa. У працы вывучаны шырока распаўсюджаныя дзеючыя рэчывы фунгіцыдаў - флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол. Флудиоксонил ўваходзіць у склад некалькіх сумесевых прэпаратаў, якія выкарыстоўваюцца для пратручвання насення і насенных клубняў перад пасадкай. Флудиоксонил (прэпарат Максім) выкарыстоўваецца таксама для апрацоўкі насенных клубняў перад закладкай на захоўванне. Дифеноконазол і азоксистробин таксама ўваходзяць у склад шэрагу прэпаратаў, якія выкарыстоўваюцца для апрацоўкі насеннага матэрыялу, а таксама ў склад прэпаратаў, прызначаных для апрацоўкі вегетирующих раслін (Дзяржаўны каталог ..., 2020).
Вывучана хуткасць росту I. crassa на асяроддзях (мал. 2) з рознымі канцэнтрацыямі дзеючых рэчываў: флудиоксонила (EC50 = 0.4 ppm), азоксистробина (EC50 = 4 ppm) і дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (табл. 2). Гэтыя прэпараты можна прызнаць высокаэфектыўнымі ў дачыненні I. crassa, так як іх EC50 істотна ніжэй рэкамендаванай канцэнтрацыі прэпарата ў рабочай вадкасці, якая выкарыстоўваецца для апрацоўкі клубняў. Згодна з Дзяржаўнаму каталогу ... (2020), канцэнтрацыя флудиоксонила ў вадкасці для апрацоўкі клубняў бульбы складае ад 500 да 1000 ppm, азоксистробина (у вадкасці для апрацоўкі дна разоры) - 3750-9375 ppm, дифеноконазола (у вадкасці для апрацоўкі вегетирующих раслін) - 187.5- 625 ppm.
Табліца 1. Падабенства сиквенсов видоспецифичных паслядоўнасцяў штаму 18KSuPT2 і наяўных у базе Genbank штамаў Ilyonectria crassa
штам | Расліна-гаспадар, месца вылучэння | Нумары сиквенсов, дэпанаваных ў GenBank, працэнт падабенстваў | Спасылка | ||
ІТС | β-тубулін | TEF 1α | |||
17KSPT1і 18KSuPT2 | Клубень бульбы, Кастрамская вобл. | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, дадзеная праца |
CBS 158/31 | Карані нарцыса, Нідэрланды | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 па |
CBS 139/30 | Цыбуліна лілеі, Нідэрланды | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Корань жэньшэня, Канада | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Ліст цюльпана, Велікабрытанія | KJ475469 100 | KJ513266 100 | НД | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Карані асіны, Канада | MT294410 100 | НД | НД | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Бук, Італія | KR019363 99.65 | НД | НД | Tizzani, Haegi, Motta. Direct submission |
KAUF19 | Клубень бульбы, Сірыя | HE649390 98.3 | НД | НД | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
НД = ня ашчаджалі
Табліца 2. Устойлівасць Ilyonectria crassa да фунгіцыдамі
(Дзеючае рэчыва) | ЕС50, ppm | ||||
3 дзень | 5 дзень | 7 дзень | |||
Кантроль | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Квадрыс, КС (фзаксістрабін) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Максім, КС (флудиоксонил) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Хуткі, КЭ (дифеноконазол) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
У нашай працы штамы I. crassa былі вылучаныя з клубняў бульбы ў Кастрамской і Маскоўскай (Chudinova et al., 2019) абласцях. Высокая доля штамаў грыбоў з сиквенсами ITS, ідэнтычнымі I. crassa, была выяўленая пры аналізе микобиоты клубняў бульбы ў Саудаўскай Аравіі (Gashgari, Gherbawy, 2013 года). Па-відаць, I. crassa сустракаецца на бульбе не так рэдка, як можа здацца. У нашых эксперыментах паказана, што грыб мог паражаць пашкоджаныя плады тамата. З літаратурных дадзеных вядома, што I. crassa здольны развівацца ў глебе сапротрофно (Moll et al., 2016), а таксама паражаць самыя розныя расліны, нават такія далёкія у таксанамічных плане, як нарцысы, лілеі, жэньшэнь, асіна, бук (табл. 1). Па-відаць, многія дзікарослыя і садовыя расліны могуць быць рэзерват I. crassa. Вышэйсказанае паказвае, што пры распрацоўцы мер абароны неабходна ўлічваць магчымасць паразы клубняў бульбы гэтым грыбом. Шырока распаўсюджаныя прэпараты для апрацоўкі клубняў бульбы, якія змяшчаюць флудиоксонил, азоксистробин і дифеноконазол, паказалі высокую фунгіцыдных эфектыўнасць у дачыненні да I. crassa.
Праца выканана пры падтрымцы РФФИ (грант № 20-016-00139).
Артыкул апублікаваная ў часопісе «Веснік аховы раслін», 2020 ды 103 (3)