Д. Ю. Разанцаў, Е. М. Чудзінава, Л. Ю. Кокаева, С. Н. Еланский, П. Н. Балабко, Г. Л. Бялова, С. К. завр
Фитопатогенный грыб Colletotrichum coccodes выклікае небяспечныя захворванні бульбы і тамата, вядомыя як антракноза і чорная плямістасць клубняў. Па марфалагічных прыкметах іх часта цяжка адрозніць ад захворванняў, выкліканых іншымі мікраарганізмамі; на зялёных плёне тамата хвароба можа працякаць бессімптомна, выяўляючыся толькі на дарослых чырвоных плёне. Для хуткай і дакладнай дыягностыкі ўзбуджальніка прапануецца тэст-сістэма для ПЦР ў рэальным часе. Для распрацоўкі тэст-сістэмы была вызначана паслядоўнасць нуклеатыдаў гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы 45 штамаў C. coccodes, вылучаных з клубняў бульбы ў розных рэгіёнах Расіі.
На падставе атрыманых вынікаў і аналізу аналагічных паслядоўнасцяў іншых відаў, якія ёсць у базе дадзеных GenBank, былі сканструяваныя видоспецифичные для C. coccodes праймер і зонд. Для праверкі спецыфічнасці створанай тэст-сістэмы праводзілі ПЦР з ДНК, выдзеленай з чыстых культур 15 розных відаў паразітычных і сапротрофных грыбоў, асацыяваных з раслінамі тамата і бульбы (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternatа, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Прысутнасць ДНК Colletotrichum coccodes вызначалася пры парогавым цыкле 20-27, тады як астатнія віды вызначаліся пасля 40 цыклаў ці не дэтэктаваліся. Тэст-сістэма дазваляе ўпэўнена дэтэктаваць ў аналізаванай ПЦР-сумесі канцэнтрацыі ДНК C. coccodes, якія перавышаюць 0.01 НГ / мм3. З дапамогай распрацаванай тэст-сістэмы было даследавана прысутнасць C. coccodes ў лісці тамата з сімптомамі паразы грыбнымі хваробамі і ў клубнях бульбы без знешніх сімптомаў захворвання. Лісце з сімптомамі грыбнага паразы былі сабраныя з двух розных палёў у Краснадарскім краі, клубні - з палёў у Кастрамской, Маскоўскай, Калужскай, Ніжагародскай абласцях. У Краснадарскім краі быў выяўлены адзін ліст тамата, які змяшчае ДНК C. coccodes; пэўнае прысутнасць ДНК гэтага патогена было выяўлена ў 5 узорах клубняў, вырашчаных у Кастрамской, Маскоўскай, Калужскай абласцях.
Увядзенне
Грыбы роду Colletotrichum - небяспечныя фитопатогены, якія дзівяць збожжавыя, агароднінныя культуры, травы, шматгадовыя пладовыя і ягадныя расліны. Адзін з паўсюдна распаўсюджаных відаў гэтага роду, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, з'яўляецца ўзбуджальнікам антракноза і чорнай плямістасці бульбы і тамата, выклікае захворванні і шэрагу іншых раслін сямейства паслёнавых, у тым ліку пустазельных (Dillard, 1992). C. coccodes дзівіць усе падземныя часткі расліны, падставы сцеблаў, лісце і плады (Andrivon et al., 1998.; Johnson, 1994). На лупіне інфіцыраваных клубняў бульбы назіраецца развіццё шэрых плям з невыразна выяўленымі бакамі, на якіх добра бачныя чорныя кропкі спороношения і микросклероциев. У працэсе захоўвання ў мякаці клубняў могуць ўтварыцца язвы з размякчаным змесцівам, г.зн. хвароба пераходзіць у фазу антракноза, што, аднак, назіраецца вельмі рэдка.
У той жа час сімптомы антракноза (язвы, пакрытыя лупінай з дробнымі чорнымі кропкамі) тыповыя на плёне тамата. На лісці сімптомы паразы С. сoccodes выглядаюць як плямы цёмна- карычневага колеру, звычайна абрамленыя тканінай жоўтага колеру (Johnson, 1994).
Развіццё чорнай плямістасці на клубнях псуе іх знешні выгляд, што асабліва выяўлена пры продажы мытого бульбы краснокожурных гатункаў. Расслаенне лупіны прыводзіць да залішняй выпарэнню і павелічэнню страт пры захоўванні (Hunger, McIntyre, 1979). Параза іншых органаў раслін прыводзіць да страт ўраджаю, што адзначалася ва ўмовах як адкрытага, так і закрытага грунту (Johnson, 1994.; Tsror et al., 1999). Захворванні, выкліканыя C. coccodes, распаўсюджаныя практычна ва ўсіх картофелепроизводящих рэгіёнах свету, у тым ліку і ў Расіі (Leesa, Hilton 2003; Belov et al, 2018). Кантроль гэтых захворванняў абцяжараны з-за недастатковай эфектыўнасці існуючых фунгіцыдаў ў дачыненні да C. Coccodes і адсутнасці ўстойлівых гатункаў (Read, Hide 1995).
Инокулюм C. coccodes можа захоўвацца на насенных клубнях (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), насенні тамата (Ben-Daniel et al., 2010), выжываць працяглы час у глебе, на раслінных рэштках (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) і ў пустазельных раслінах (Raid, Pennypacker, 1987). Працамі шэрагу аўтараў (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997.; Dillard, Cobb, 1993) паказана, што развіццё захворвання на бульбе і тамаце ў значнай ступені залежыць ад прысутнасці инокулюма ў насенным матэрыяле і ў глебе. Таму для мінімізацыі страт ад захворвання неабходная дыягностыка (у тым ліку колькасная) пропагул грыба ў насенным матэрыяле, у глебе, у закладываемых на захоўванне насенных клубнях бульбы і насенні тамата. Марфалагічная дыягностыка ў глебе і раслінным матэрыяле можа праводзіцца толькі па прысутнасці микросклероциев, якія, аднак, сустракаюцца і ў іншых відаў грыбоў.
Сімптомы на клубнях вельмі падобныя на серабрыстую Паршу, выкліканую грыбом Helminthosporium solani. Вылучэнне Colletotrichum coccodes і Helminthosporium solani ў чыстую культуру даволі складана і займае працяглы час у сувязі з павольным ростам на пажыўнай асяроддзі. Для хуткага выяўлення Colletotrichum coccodes неабходна выкарыстанне інструментальных метадаў дыягностыкі. Найбольш зручным метадам з'яўляецца палімеразную ланцуговая рэакцыя (ПЦР) і яе мадыфікацыя - ПЦР ў рэальным часе. У цяперашні час у краінах Еўропы і ЗША выкарыстоўваецца тэст-сістэма, распрацаваная англійскімі даследнікамі (Cullen et al., 2002) да ITS1 участку рДНК. Яе выкарыстанне паказала добрыя вынікі і пры аналізе расійскіх изолятов (Belov et al, 2018). Аднак C. coccodes валодае высокай зменлівасцю і яго выяўленне па адной паслядоўнасці ДНК можа прывесці да ложноотріцательные вынікаў. Для большай пэўнасці дыягностыкі неабходны аналіз па некалькіх видоспецифичным паслядоўнасцях ДНК, у сувязі з чым намі была распрацавана арыгінальная тэст-сістэма, якая дазваляе ідэнтыфікаваць C. coccodes па паслядоўнасці гена глицеральдегид-3-фосфатдегідрогеназы.
Матэрыялы і метады
Для ацэнкі эфектыўнасці і спецыфічнасці створаных тэст-сістэм былі выкарыстаныя чыстыя культуры 15 відаў грыбоў, выдзеленых аўтарамі з здзіўленых узораў лісця і пладоў тамата, клубняў бульбы (табл. 1). Для вылучэння бралі органы раслін з сімптомамі грыбнага паразы, не больш аднаго органа з куста.
Зрэз клубня з лупінай, лустачку плёну тамата, уражаны ліст змяшчалі пад бінакулярны мікраскоп, пасля чаго востра заменчанай препаровальной іголкай міцэліем, спрэчкі або кавалачак тканіны пераносілі на агаризованную сераду (сусло-агар) у кубку Петры. Захоўвалі изоляты на скошанай агаризованной асяроддзі ў прабірках пры 4 ° С.
Прызначаныя для аналізу ўзоры лісця тамата з сімптомамі паразы грыбнымі хваробамі адразу пасля збору (на поле) змяшчалі ў 70% -й этылавы спірт у якім і захоўвалі да вылучэння ДНК. Клубні бульбы дастаўлялі ў лабараторыю, з іх здымалі лупіну (кавалачак 2 × 1 см) і замарожвалі на -20 ° С. У замарожаным стане захоўвалі да вылучэння ДНК.
Чыстыя культуры грыбоў для вылучэння ДНК вырошчвалі ў вадкай гарохавай асяроддзі. Міцэліем грыба здабывалі з вадкай асяроддзя, падсушваюць на фільтравальнай паперы, замарожвалі ў вадкім азоце, гомагенізаваных, інкубаваць ў ставіш-буферы, чысцілі хлараформам, аблажылі сумессю изопропанола і 0.5м ацэтату калія, 2 разы прамывалі 70% -м спіртам. Атрыманую ДНК раствараюць у деионизированной вадзе і захоўвалі пры -20 ° С (Kutuzova et al., 2017). Канцэнтрацыю ДНК вымяралі з выкарыстаннем набору HS DNA quantification kit для двухцепочечной ДНК на Qubit 3.0 (Qiagen, Германія). Заспіртаваны і замарожаныя ўзоры расціраў ў вадкім азоце, далей праводзілі вылучэнне ДНК аналагічна апісанаму вышэй (для міцэліем чыстых культур грыбоў).
Табліца 1. Паходжанне выкарыстаных у працы штамаў грыбоў
Назва грыба | Расліна, орган | месца вылучэння |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | клубень бульбы | Кастрамская вобл., Клубні бульбы 1-га палявога пакалення, гатунак Рэд Скарлет |
Colletotrichum coccodes 4 | ліст бульбы | Рэсп. Марый Эл, г. Йошкар-Ола |
Helminthosporium solani | клубень бульбы | Магаданская вобл., Пас. Палатка, клубень бульбы |
Cladosporium fulvum | ліст тамата | Маскоўская вобл., Крупноплодный тамат |
Alternaria tomatophila | плод тамата | перададзены супрацоўнікамі лабараторыі мікалогіі і фітапатолаг ВНДІ аховы раслін |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternatа, Phellinus ferrugineovelutinus, Stem-phylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | плод тамата | Краснадарскі край, Крымскі р-н, гатунак Сліўка |
Fusarium oxysporum | корань пшаніцы | Маскоўская вобл. |
ПЦР праводзілі на амплификаторе DTprime (ДНК-Тэхналогія). Для правядзення ПЦР выкарыстоўвалі арыгінальныя праймер і зонд на видоспецифичный ўчастак гена глицеролтрифосфат-дэгідрагеназ: прамы праймер Coc70gdf -TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, зваротны праймер Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGA, зонд Cocgdz - (BHQ1) -AGTGTGCTTGAGA- (FAMdT) -GGGCTGCTGCCG (p). Праймер амплифицируют ўчастак памерам 213 пн.
У рэакцыю бралі 50 НГ татальнай ДНК (пры аналізе лісця і клубняў) і 10 НГ (пры аналізе ДНК чыстых культур грыбоў). Рэакцыйная сумесь (35 мкл) падзялялася парафінавай праслойкай на дзве часткі: ніжняя (20 мкл) ўтрымоўвала 2 мкл 10 × рэакцыйнага буфера (750 mМ Tris-HCl, рН 8.8; 200 mМ (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 мм кожны дезоксинуклеотидтрифосфата, 7 пмоль кожнага праймер і 4 пмоль гидролизуемого флуоресцентной зонда; верхняя содержала1 мкл 10 × буфера для ПЦР і 1 адз Taq-полимеразы.
Падзел сумесі парафінам дазваляе доўга захоўваць прабіркі пры тэмпературы 5 ° С і забяспечыць гарачы старт ПЦР пасля іх прагрэву на працягу 10 мін пры тэмпературы вышэй 80 ° С. ПЦР праводзілі па наступнай праграме: 94.0 ° C - 90 с (1 цыкл); 94.0 ° C - 30 с; 64.0 ° C - 15 с (5 ЦВК-лоўлю); 94.0 ° C - 10 с; 64.0 ° C - 15 з (45 цыклаў); 10.0 ° C - захоўванне.
Вынікі і абмеркаванне
Паслядоўнасці гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы былі вызначаны ў 45 штамаў, вылучаных з лісця, сцеблаў, клубняў бульбы і пладоў тамата (Kutuzova, 2018) у розных рэгіёнах Расіі. Даследаваныя паслядоўнасці ўсіх штамаў падзяліліся на 2 групы, якія адрозніваюцца двума нуклеатыдаў. У GenBank дэпанаваныя нуклеотидные паслядоўнасці прадстаўнікоў абедзвюх груп за нумарамі KY496634 і KY496635.
Сканструяваныя на іх аснове праймер coc70gdf, coc280gdr і зонд cocgdz правяралі з дапамогай праграмы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) На ўсіх наяўных у базе GenBank паслядоўнасцях гена глицеролтрифосфатдегидрогеназы відаў роду Colletotrichum і іншых арганізмаў.
Участкаў ДНК іншых арганізмаў, высока гамалагічных праймер і зонду, выяўлена не было.
Адчувальнасць тэст-сістэмы правяралі з выкарыстаннем пробаў з рознымі канцэнтрацыямі ДНК C. coccodes, ДНК здзіўленага антракнозом ліста бульбы (сабраны ў 2017 г. у Марый Эл, гатунак Рэд Скарлет), і лупіны клубняў, здзіўленых чорнай плямістасцю (сабраны ў Кастрамской вобл., гатунак Рэд Скарлет, табл. 2). Для пацверджання прысутнасці ДНК у клубнях і ў лісце бульбы з іх былі вылучаныя ў чыстыя культуры штамы C. coccodes.
Вынікі аналізу адчувальнасці тэст-сістэмы паказваюць, што з яе дапамогай можна паспяхова дыягнаставаць наяўнасць ва ўзоры ДНК C. coccodes пры яе сумарным утрыманні ў ПЦР-сумесі больш 0.05 НГ. Гэтага цалкам дастаткова для дэтэкцыі, паколькі ў адным склероции ўтрымліваецца ў сярэднім 0.131 НГ, а ў адной спрэчцы - каля 0.04 НГ ДНК (Cullen et al., 2002). Тэст-сістэма, распрацаваная ангельскай групай (Cullen et al., 2002), паказала падобную, адчувальнасць (парогавы цыкл 34 пры 0.05 НГ ДНК і 37 пры 0.005 НГ).
Аналіз прыродных узораў, якія змяшчаюць C. coccodes ва ўсіх выпадках дазволіў пэўна вы-явіць яго прысутнасць у спробе (табл. 2). Прапанаваны метад выдзялення ДНК таксама апынуўся ў дачыненні для аналізу прыродных раслінных узораў.
Табліца 2. Вызначэнне адчувальнасці прапанаванай тэст-сістэмы ідэнтыфікацыі Colletotrichum coccodes для ПЦР ў рэальным часе
ўзор | Колькасць ДНК у спробе *, НГ | парогавы цыкл | Дэтэкцыі C. coccodes |
---|---|---|---|
Міцэліем Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Лупіна клубня 1 | 50 | 32 | + |
Лупіна клубня 2 | 50 | 30 | + |
Лупіна клубня 3 | 50 | 31.5 | + |
ліст бульбы | 50 | 29.5 | + |
Заўвага. * У сумесі прадуктаў ПЦР.
Праверка спецыфічнасці тэст-сістэмы праводзілася на узорах ДНК, экстрагаваныя з 15 відаў грыбоў. Усе штамы грыбоў былі вылучаныя аўтарамі з здзіўленых і здаровых пладоў і лісця тамата, клубняў бульбы; адзін штам быў выдзелены з кораня пшаніцы (табл. 1). Сярод вылучаных з паверхні плёну ёсць і непатогенный для тамата віды (напрыклад, Phellinus ferrugineovelutinus).
Даследаванні паказалі, што ДНК C. coccodes выяўляецца, пры парогавым цыкле 20-27, тады як астатнія віды грыбоў ня дэтэктаваліся або давалі сігнал пасля 40 цыклу, што можна аднесці да неспецыфічныя шумавым эфекту (табл. 3).
Табліца 3. Праверка тэст-сістэмы на грыбах розных відаў
Назва грыба | парогавы цыкл |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
С. коккоды 2 | 22.6 |
С. коккоды 3 | 23 |
С. коккоды 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternatа | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
пеницилл зр. | > 40 |
Заўвага. * Колькасць ДНК ва ўсіх пробах было 10 НГ.
Распрацаваная тэст-сістэма была выкарыстаная для ідэнтыфікацыі C. coccodes ў узорах лісця тамата з сімптомамі паразы некротрофными патагенамі і клубняў насеннай бульбы без бачных сімптомаў. Для даследавання былі ўзятыя насенныя клубні розных смецце-тов, вырашчаных у Кастрамской, Маскоўскай, Калужскай, Ніжагародскай абласцях. Пэўным прысутнасць ДНК C. coccodes лічылі ў узорах, пры аналізе якіх парогавы цыкл не перавышаў значэння 35. Гэта парогавае значэнне было абрана зыходзячы з дакладных вызначэння 0.05 НГ ДНК C. coccodes (парогавы цыкл 33.5, табл. 2) і таго факту, што пры парогавых цыклах вышэй 40 дыягнаставалася неспецыфічныя ДНК некаторых іншых відаў грыбоў. Пры такім падыходзе пэўнае прысутнасць ДНК C. coccodes было выяўлена ў 5 узорах клубняў, вырашчаных у Кастрамской, Маскоўскай, Калужскай абласцях і ў адным лісце тамата з Ейск р-на Краснадарскага краю (табл. 4, 5).
Табліца 4. дэтэкцыі Colletotrichum coccodes на клубнях бульбы *
нумар ўзору | гатунак бульбы | месца вырастання | Дэтэкцыі C. coccodes | парогавы цыкл |
---|---|---|---|---|
1 | Рэд Скарлет | Кастрамская вобл. | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Сантэо | Маскоўская вобл. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Жукоўскі ранні | Маскоўская вобл. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Молі | Калужская вобл. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Фантазія | Калужская вобл. | - | |
15 | гала | Ніжагародская вобл. | - | |
16 | - |
Заўвага. * Колькасць ДНК ва ўсіх пробах было 50 НГ.
Табліца 5. дэтэкцыі Colletotrichum coccodes на лісці тамата *
нумар ўзору | месца вырастання | Дэтэкцыі C. coccodes | парогавы цыкл |
---|---|---|---|
1 | Краснадарскі край, Крымскі р-н | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Краснадарскі край, Ейск р-н | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Колькасць ДНК ва ўсіх пробах было 50 НГ.
Створаная намі тэст-сістэма не саступае распрацаванай англійскімі даследнікамі (Cullen et al., 2002) па адчувальнасці і спецыфічнасці і падыходзіць для аналізу раслінных узораў. Яе прымяненне для аналізу насенных клубняў дазволіла выявіць ДНК C. coccodes у клубняў без знешніх прыкмет паразы і паспяхова правесці аналіз заражанасці лісця.
У Расіі да гэтага часу не праводзілі аналізу клубняў бульбы на здзіўленага C. coccodes. Наша ўпершыню праведзенае даследаванне паказала, што з 16 пратэставаных насенных клубняў, вырашчаных у розных рэгіёнах РФ, 5 ўтрымліваюць C. coccodes. Гэта паказвае, што чорная плямістасць клубняў бульбы - звычайная захворванне бульбы ў Расіі, і яго ролю ў зніжэнні аб'ёму і якасці ўраджаю бульбы недаацэненая.
Пры аналізе лісця тамата пэўнае прысутнасць ДНК C. coccodes выяўлена ў адным лісце з Ейск р-на Краснадарскага краю. Раней пры абследаванні палёў тамата на поўдні Расіі з дапамогай брытанскай тэст-сістэмы (Cullen et al., 2002) былі выяўлены лісце, якія змяшчаюць C. coccodes, прычым на некаторых палях выяўленая высокая доля лісця, здзіўленых C. coccodes (Belov et al., 2018). У Краснадарскім і Прыморскім краях, Маскоўскай вобласці намі былі выяўленыя плён тамата, з якіх удалося вылучыць чыстыя культуры C. coccodes. Магчыма, на тамаце ў Расіі C. coccodes распаўсюджаны значна шырэй, чым лічыцца цяпер, і яго шкоднаснасць таксама недаацэненая.
Такім чынам, на гэты час назапасілася дастаткова інфармацыі пра шырокае распаўсюджанне C. coccodes на бульбе і тамаце.
Для лепшага разумення ролі гэтага грыба ў развіцці хвароб бульбы і тамата неабходны шы-рокий маніторынг распаўсюджанасці яго ў Расеі, вывучэнне ролі глебавай і насеннай інфекцыі, ролі чорнай плямістасці ў стратах пры захоўванні. Прымяненне ПЦР-дыягностыкі можа істотна палегчыць правядзенне гэтай працы, а адначасовае прымяненне абедзвюх тэст-сістэм дазволіць істотна павялічыць дакладнасць аналізу.
Праца падтрымана грантам РНФ № 18-76-00009.
Артыкул апублікаваная ў часопісе «Мікалогія і фітапатолаг» (том 54, №1, 2020 г.).